等温遺伝子増幅法を用いたボツリヌス毒素の高感度検出法の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790292
• Research Institution: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• Principal Investigator: 河合 高生 大阪府立公衆衛生研究所, 感染症部・細菌課, 主任研究員 (30250319)
• Keywords: ボツリヌス毒素 / rolling circle amplification / 等温遺伝子増幅法 / ELISA法

Research Abstract

rolling circle amplification法(RCA法)について検討を行った。まず、鋳型に用いる環状1本鎖DNAの作製法を検討した。1本鎖DNAを環状化するために用いるligase、exonuclease等の酵素類の種類や反応時間、環状化した1本鎖DNAの精製方法について様々な条件検討を行い、環状1本鎖DNAの精製に成功した。次にRCA法に適したDNA polymeraseを見つけるために、RCA法に関する論文で用いられていたSequenase2.0(usb)、T7 DNA polymerase (usb)、Bst DNA polymerase (NEB)、phi29 DNA polymerase (NEB)を用いて等温でRCA反応を行った。増幅の有無は、増幅産物をアガロースゲル電気泳動しエチジウムブロマイド染色することにより確認した。その結果、phi29 DNA polymeraseを使用した時に最も高い増幅効果が認められた。
本法に用いる抗体とプライマーの化学結合体(Ab-DNA結合体)の合成および精製法についてはその実験条件を検討中のため、予定していたRCA法によるBoNTの検出系の開発には至らなかった。
ELISA法によるボツリヌス毒素(BoNT)の検出法を確立する上で必要な抗A型BoNT抗体および抗B型BoNT抗体を作製した。トキソイド化したA型BoNT、B型BoNTをそれぞれウサギに免疫し、数週間間隔で採取した血清を用いてELISA法で抗体価の上昇を確認した。抗体価の上昇が認められたウサギの全採血を行い血清を採取した。採取した各血清からprotein Gカラムを用いて、抗A型BoNT IgGおよび抗B型BoNT IgGを精製した。