等温遺伝子増幅法を用いたボツリヌス毒素の高感度検出法の開発

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15790292
• Research Institution: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• Principal Investigator: 河合 高生 大阪府立公衆衛生研究所, 感染症部, 主任研究員 (30250319)
• Keywords: ボツリヌス毒素 / rolling circle amplification / 等温遺伝子増幅法 / ELISA法

Research Abstract

診断用ボツリヌスウマ抗毒素(A型)のProteinG吸着画分、昨年度作製した抗4型および抗B型ボツリヌス神経毒素IgG画分、ビオチン標識したこれらのIgG画分を用い、サンドイッチELISA法によるA型およびB犁ボツリヌス毒素の検出法を構築した。特殊なプレートを使用することにより通常のELISA法の1/3量のサンプル量で測定できる系に改良した。検出下限を陰性対照サンプルの吸光度の2倍と定めた場合、A型およびB型ボツリヌス神経毒素の検出感度はそれぞれ0.2〜0.5ng/ml、0.1〜0.3ng/mlであった。本研究で構築・したELISA法を用いて、ボツリヌス菌を接種し毒素を産生させた食品(黒豆)の毒素検査を実施した。マウス試験で測定した毒力から換算した毒素量とELISA法の値はほぼ一致したことから、構築したELISA法は食品の毒素検査に応用できると考えられた。
ELISA法の検出系に等温遺伝子増幅法であるrolling circle amplification、法(RCA法)を応用した毒素検出システムを構築するため、検出用抗体に遺伝子増幅用プライマーを化学的に結合させた。精製段階で非特異反応の原因となる未結合プライマーを完全に除去できなかったため、アビジン・ビオチンの反応性を利用して抗体とプライマーを結合させた後にRCA法を実施し検出するシステムに変更した。予備実験で固相化したストレプトアビジンをビオチン標識プライヤーを用いたRCA法により検出できることを確認した。そこで本システムにより毒素の検出を試みたところ、非特異反応を生じ毒素を検出できなかった。反応バッファーを改良するなどして非特異反応を抑えることには成功したが、バックグラウンド値が高く期待した感度の上昇は認められず、逆に感度が低下した(5ng/ml)。現在、実験方法を精査しこれらの問題の解決方法を検討中である。