定量リン酸化プロテオミクスによる大規模リン酸化ストイキオメトリー解析

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15F15343
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 石濱 泰 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30439244)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): TSAI CHIA-FENG 京都大学, 薬学研究科(研究院), 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2015-11-09 – 2018-03-31
• Keywords: プロテオーム / 翻訳後修飾 / リン酸化プロテオーム / ストイキオメトリー

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ホスト研究室が得意とする翻訳後修飾・定量プロテオミクス技術をベースとし、候補者が得意とする新規手法開発と細胞生物学への応用を行うものである。具体的には、細胞内で生じている数万種のタンパク質リン酸化修飾それぞれに対し、基底状態でのリン酸化ストイキオメトリー（部位ごとのリン酸化されている割合）がどのくらいで、どのような刺激が加わると、ストイキオメトリーがどのくらいの時間でどのくらい変動するのかを測定し、システム生物学的観点から、細胞機能とストイキオメトリー絶対値もしくは変動値がどのような関係にあるのかを一網打尽に解明しようとする研究である。本年度は、第一ステップとして、10種の複数試料を同時にLC-MS解析可能な新規の細胞内リン酸化修飾ストイキオメトリー測定法開発を行った。具体的には脱リン酸化ステップ、10-plexアイソバリックタグ化ステップおよび18O-ATPを用いた酵素的リン酸化反応を統合し、10種類の試料について、内在性のリン酸化修飾とin vitroリン酸化修飾を個別に定量する方法の確立を検討した。10-plexアイソバリックタグ化反応の最適条件の検討を行うとともに、リン酸化ぺプチド濃縮およびLCMS測定におけるタグ化の影響を定量的に評価し、それぞれの最適な条件の抽出を行った。また、18O-標識リン酸化ペプチドに対するデータ解析システムの構築も行い、16O-標識体との相対定量の高精度化を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

約4か月の研究期間ではあるが、当初の計画の通り、測定系の立ち上げに成功しており、今後の計画の順調な推移が期待できる。

Strategy for Future Research Activity

当初の予定通り、10種の複数試料の細胞内リン酸化修飾ストイキオメトリー測定法の確立を検討するとともに、ガン等のリン酸化修飾が原因となっている疾病におけるリン酸化ストイキオメトリーの大規模解析を行う。具体的には、ターゲットモチーフに異なるチロシンキナーゼを組み合わせた酵素的リン酸化反応を用いて、今まで定量が困難であったチロシンリン酸化修飾ストイキオメトリーへの適用を検討する。