2015 Fiscal Year Annual Research Report
ssPalmが拓くマルチ創剤基盤：生体内包括イムノエンジニアリングと次世代癌治療
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15H01806
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
秋田 英万 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (80344472)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌免役 / ナノ粒子 / ドラッグデリバリーシステム / ワクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
効果的な癌ワクチンを開発するためには、『細胞性免疫』を誘導し、『抑制的な腫瘍内免疫環境』を矯正する技術が必要である。本研究では、細胞内微小環境（低pH及び還元環境）に応答して帯電・崩壊する、脂質様材料（SS-cleavable pH-activated lipid-like material: ssPalm）を共通のプラットフォームとし、癌免役療法の実現を目指した2種の製剤を開発する。
（細胞性免疫を活性化するＤＮＡワクチン技術）細胞内環境応答性と高い生体適合性を有する新規脂質様材料を導入し、さらに表面修飾素子(KALA)に改良を加えながら、汎用性の高いin vivo直接投与型DNAナノワクチン製剤を開発する。
（腫瘍免疫環境を矯正する難水溶性薬物搭載微粒子）従来のリポソームよりも小さな（<50 nm）血中滞留性超微粒子製剤を新規脂質様材料との『共集合』原理に基づき開発する。
最終的にはこれらの技術を組み合わせ、生体内・腫瘍内の免疫を包括的に操作する『イムノエンジニアリング』を確立し、癌を『治療』するための新しい医療技術を提唱することを目的とする。初年度はssPalmや表面修飾素子(KALA)の分子チューニングにより材料自身を改良すると共に、自己組織化制御の観点から、遺伝子の内封技術や難水溶性薬物の超微粒子化技術を確立した。KALAに関しては、オリジナルのKALA配列から系統的に配列を改変し、樹状細胞に対する遺伝子導入ならびに免役活性化能を促進するための最小単位を同定した。また、ssPalmと組み合わせるヘルパー脂質や、調整法の改変により、同一組成からなる様々な粒子系の粒子を調製できることを見出した。さらに、ナノ粒子の表面および内部構造に関して、各種の蛍光技術を用いて解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNAワクチン用ナノ粒子の開発の観点からは、免疫担当細胞の活性化効果が報告されているビタミンＥを脂溶性足場としたssPalmを開発した。エンドソーム内の微弱なpH変化を敏感に感知して正に帯電し、エンドソーム膜を破壊できるようにssPalmの第三級アミン構造をチューニングした。一方、ssPalmに対して、様々な種類のKALAペプチド誘導体を修飾した結果、オリジナルのKALA配列と同等の活性を有する、短い配列（最小単位）を同定することに成功した。また、ＣＤスペクトルの解析により、遺伝子導入や免役活性化機構が消失したペプチドに関しては、αヘリクス構造が消失することが明らかとなった。
また、物理学的な観点から、ssPalm粒子の表面が中性環境下でゲル相に近い構造をとっていること、pＨが低い環境下において水分子の侵入しやすい性質となること、さらには、その内部構造はpHによらず常に流動的であることを見出した。本粒子表面に水溶性ポリマーを修飾することにより、血中滞留性や癌への蓄積が上昇することも見出した。さらに、難水溶性薬物の搭載については、難水溶性薬物として、4-メチルウンベリフェロンを選択し、ssPalm粒子への搭載をこころみた。本薬物自身の封入率は低いものであったが、疎水性基を導入し、より親油性を高めることにより、その封入率は劇的に改善した。また、細胞内環境を模倣した還元状態において、本薬物が極めて効率的に放出できることが明らかとなった。本特徴は、従来の脂質を用いた製剤では見られない特徴である。
表面修飾素子やナノ粒子形成材料（ssPalm)の機能的な最適化や、ssPalm粒子へ薬物を搭載するための基本的な条件を設定することができた点で、当初の目的を達成することができたと言えよう。
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| Strategy for Future Research Activity |
腫瘍組織、あるいは個体レベルにおけるナノ粒子の動態・機能を評価しながら、in vivo皮下投与型のDNAナノワクチンや、腫瘍標的型の低分子デリバリーシステムを完成させることを目標とする。ex vivo樹状細胞における機能を指標として選択したssPalm材料や脂質組成を初期値とし、in vivoで機能するDNAワクチン製剤へと最適化する。本改良においては、皮下投与部位の遺伝子発現活性や細胞性免疫が誘導された際に産生されるサイトカイン（IFNγ等）の血中レベルを指標とする。遺伝子発現評価においてはルシフェラーゼをマーカー遺伝子として用い、in vivoイメージングシステム（IVIS Imaging System）により経時的に解析する。また、最適化されたDNAナノワクチンの免疫による、抗原特異的な細胞障害性T細胞（CTL）の誘導能を評価する。モデル抗原遺伝子としてOVAを用いて免疫し、同マウスに投与される抗原エピトープ提示脾臓細胞の生存率をCTL活性の指標とする。
一方で、ssPalm粒子を用いた低分子デリバリーに関しては、粒子表面に修飾する水溶性ポリマー(ポリエチレングリコール：PEG)の長さや密度を最適し、難水溶性薬物とssPalmから成る共集合型超微粒子の腫瘍送達量が最大となる修飾条件を決定する。また、腫瘍組織のホモジネート中における薬物量をHPLC等により定量化し、搭載薬物の腫瘍到達を確認する。また、従来のリポソームサイズの粒子（>100 nm）と、超微小粒子（<50 nm）の腫瘍内分布を観察し、最小径に制御された粒子の腫瘍深部への薬物送達技術としての有用性を実証する。蛍光標識されたこれらサイズの異なる粒子を血中に投与し、腫瘍内分布を共焦点レーザー顕微鏡にて評価する。
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Research Products
(14 results)
