2016 Fiscal Year Annual Research Report
高速人工抗体創製法 の開発とタンパク質 １分子単位定量への 応用
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15H02006
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
村上 裕 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (10361669)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢島 潤一郎 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (00453499)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 一分子定量 / 人工抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H27度は、モデルタンパク質であるVEGFR2に対する抗体の選択をTRAP提示法を用いて行い、高い親和力を持つ人工抗体を得ることに成功している。ただ、この過程で、選択操作を繰り返すたびに遺伝子が短くなるなど、本来はペプチドの選択系として開発したTRAP提示法の問題点も見えてきた。そこでH28年度は、その原因を探り、これがmRNA-DNAピューロマイシンリンカー複合体の形成効率が低くなっているためであることをつきとめた。さらに、この形成効率の低下は、修飾したDNAを使用することで抑制できることを発見し、人工抗体選択系の大きな問題点を解決することに成功した。
さらに、少数タンパク質を含む標的タンパク質を10種類選定し、これを動物細胞からクローニングして大腸菌に発現させた。10種類のうち正しく発現した4種類を用いて、実際にTRAP提示法を用いた選択をおこなった。6回の選択操作を繰り返したが、標的タンパク質に結合する人工抗体は現在のところ得られていない。その大きな原因は、大腸菌による標的タンパク質発現系であると考えている。H29年度は動物細胞で、正しい折りたたみをもつタンパク質を発現することで、標的タンパク質の質を高めて、人工抗体の取得に挑む。
本研究の目的のためには、1細胞を破砕して、その内部のタンパク質を基板に効率よく固定化する技術が必要である。そこで、簡便に1細胞をガラス基板上に取り出し、その内容物を基板上に固定化する技術の開発に取り組んだ。その結果、1細胞を取りだし発現させた緑色蛍光タンパク質（GFP）を基板上に固定化して、これを全反射照明蛍光顕微鏡 (TIRF)を使って検出することに成功した。今後は、基板の修飾方法など、タンパク質の効率的な固定化方法を目指す。
このようにH28年度は、研究の最終目標に達するまでの個々の技術を平行して開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度に、TRAP提示法を使用してモデルタンパク質であるVEGFR2に高い親和性で結合する人工抗体の取得に成功した。しかし、この人工抗体を作製する段階で、本来はペプチドの選択のために作製したTRAP提示法が、必ずしも人工抗体の選択には最適ではないことが分かってきた。その大きな原因は、ペプチドに比べて人工抗体の遺伝子が長く、効率的にmRNA-ピューロマイシン複合体が形成できないためであると考えられた。そこで本年度は、効率的なmRNA-ピューロマイシン複合体の形成のために様々な条件を検討した。その結果、mRNAとアニールをするDNAを修飾をもつものに置き換えることで、効率よくmRNA-ピューロマイシン複合体が形成されることが分かった。
さらに少数タンパク質を含む10種類の遺伝子をA549細胞のcDNAからクローニングし、tRNAを動物細胞タンパク質発現用に補完した大腸菌で発現させた。このうち完全長が発現した4種類のタンパク質について精製を行い、これを磁気ビーズに固定化して、TRAP提示法による選択を行った。選択操作は6回行ったが、現在のところ目的の人工抗体は得られていない。これは、ヒトの標的タンパク質を大腸菌で発現しているため一定の正しい折りたたみ構造を持っていないためであると考える。
本研究を推進するためには、1細胞を分離してガラス基板上で溶解しタンパク質を基盤に固定化する技術が必要である。そこで、GFPを発現したHela細胞を培養し、ここから1細胞をマイクロインジェクターで分取して、ガラス基板にまく技術を確立した。次に、これに様々な細胞溶解試薬を使って、細胞が効率よく溶解する条件を見つけた。またガラス基板もポリリシンで修飾することで、タンパク質が効率よく固定化されることが分かった。さらに、固定化されたタンパク質からGFPの蛍光を、 TIRFで検出することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
H28年度の研究により、TRAP提示法に関しての大きな問題点は解決し、実際に選択操作を問題なく行えるようになった。しかし、まだ、提示効率がペプチドに比べて低い点に問題がある。次年度は、翻訳系の個々の因子の遺伝子設計や、発現の条件、精製の条件、濃度などを最適化して、人工抗体選択系のさらなる効率化を行う。
また、H28年度では、標的タンパク質の発現に多くの時間を費やした。最終的には、大腸菌で様々な発現条件を試すことで、なんとか4種類の標的タンパク質について発現と精製に成功したが、実際にこれをセレクションの標的として使用しても人工抗体は得られなかった。これは、大腸菌で発現したタンパク質が、その折りたたみ構造を保持していないためであると考えられる。そこで本年度は、プラスミドを動物細胞用に作り直し、これを浮遊CHO細胞に導入することで、CHO細胞を用いた標的タンパク質発現を行う。これを精製し、磁気ビーズに固定化してTRAP提示法で選択操作を繰り返すことで、望みの人工抗体を得ることを試みる。
1細胞の破砕と、タンパク質の固定については、そのガラス基板上の修飾方法を検討する。H28年度は、タンパク質の固定化のためにポリリシンを用いていたが、（１）ポリリシンが、人工抗体による検出段階でも人工抗体を基板上に静電相互作用で引きつけてしまう、（２）塩基性タンパク質は固定化できるが、酸性タンパク質の固定化効率が悪くなってしまう、などの問題点が考えられる。そこで、ガラス基板を共有結合を形成できる官能基で修飾して、タンパク質の効率の良い固定化条件を探索する。
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Research Products
(2 results)
