ヘムシグナルによる赤血球とマクロファージの応答制御の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H02506
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 五十嵐 和彦 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00250738)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 張替 秀郎 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50302146)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヘム / Bach1 / 赤血球 / マクロファージ / 質量分析

Outline of Annual Research Achievements

Bach2のヘムによる制御機構については、構造と結合因子の観点から研究を進めた。Bach2のヘム結合領域について質量分析計を用いた表面荷電状態の測定を進め、同領域は天然変性状態にあること、ヘム結合により特定の二次構造が誘導されることはなく、ヘム結合時でも天然変性状態にあることを確認した。しかし、この天然変性状態はヘムの有無で状態が明確に異なることも見いだした。この天然変性状態のヘムによる構造制御について、その生理的意義を明らかにするために、ヘム依存性に天然変性領域に結合する因子について、定量的解析を行い、解離定数などを決定した。ヘムが両者の結合を大きく変える事から、Bach2の天然変性領域はヘム結合時には特定の構造（ただし大きく揺らぐ）をとり、タンパク質間相互作用が変化することが考えられた。これまで知られているヘム結合タンパク質は安定な二次構造を介した結合であるが、Bach2の場合にはヘムがその天然変性領域に直接結合して天然変性状態を調節するという、全く新しい概念を提唱することができた。
鉄欠乏応答におけるBach1の役割については、MEL細胞を用いたChIP-sequenceの結果から、Bach1はこれまで解明してきた転写抑制作用に加え、転写活性化作用も有することを見いだした。さらに、Bach1は赤血球分化に必須とされる転写因子遺伝子の発現を鉄欠乏時に維持することを見いだした。
マクロファージにおける機能については、Bach1 floxedマウスの作製を進め、neoマーカーを取り除いたマウスを得た。現在、細胞特異的Cre発現マウスとの交配を進めている。Bach2についてはマクロファージ特異的ノックアウトを得、組織マクロファージの分化や機能の異常について詳細に調べつつある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

特によく進んだ点は、ヘムによるBach2の構造制御であった。これまでのヘム結合タンパク質は、全て安定な二次構造（αヘリクスやβシート）を介してヘムを結合している。一方、Bach2の場合、ヘムはBach2の天然変性領域に結合すること、そしてヘム結合が特定の二次構造を誘導することはなく、ヘム結合時においても天然変性状態にあることを、原理が異なるいくつかの測定方法により確定することができた。しかも、ヘム有る無しで天然変性状態のあり方（揺らぎの程度とも言えるかも知れない）が変化することも示すことができた。これは大きな進歩と考えている。このようなヘムによる天然変性状態の制御機構は、これまでにない全く新しい概念と言える。しかし次の大問題は、このような制御機構の生理的意義となる。この点についても、以前の研究で同定していたBach2天然変性領域結合因子が、ヘムに依存してBach2に結合することを確定することができたことは、もう一つ大きな進展だったと考える。なぜなら、この知見も、ヘム有る無しで天然変性状態のあり方が変化するというコンセプトを強く支持するものであり、さらに、この結合因子がヘム天然変性状態制御のアウトプットをつくり出している可能性もある。今後は、この因子の生理的意義、そしてその役割とBach2やヘムとの関係を探ることで、ヘムによるBach2の制御に関して、完結を目指して行く。

Strategy for Future Research Activity

Bach2天然変性領域結合因子はタンパク質リン酸化酵素であることから、天然変性領域のリン酸化が同因子により行われ、これがヘムにより制御される可能性を追求していく。既にリン酸化酵素の組み換え体を得ているので、試験管内リン酸化反応を行い、質量分析計を用いてリン酸化部位を特定する。この際、安定同位体を用いてヘムの有る無しでリン酸化程度が変化する部位を特定する。このような部位を特定することができた場合には、この部位に変異を導入し、リン酸化欠失型やリン酸化ミミック型のBach2をつくる。これらBach2をBリンパ球等に導入し、その制御能の変化を調べることで、ヘムによるBach2天然変性状態制御の生理的意義を解明していく。
鉄欠乏性貧血におけるBach1の役割についても、このリン酸化酵素に着目して研究全体を見直してみたい。Bach1のヘム結合部位も天然変性状態にあることから、Bach1もこのリン酸化酵素とヘム依存的に結合する可能性がある。この点を重点的に調べる。さらに、Bach1が転写活性化に作用する可能性を見いだしているので、このリン酸化によりBach1の転写抑制能と活性化能がスイッチする可能性も探る。並行してBach1複合体解析をMEL細胞で実施し、転写活性化関連因子との相互作用を調べる。
充足率で研究実施を見送っていたヘムシグナル測定系については、Bach2とリン酸化酵素を用いて作成できそうか、状況を見ながら判断していきたい。
Bach1およびBach2ノックアウトマウスにおける鉄代謝変化やマクロファージ機能変化については、計画通り検討を進めていく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Jawaharlal Nehru Center for ASR(インド)
  • Country Name: INDIA
  • Counterpart Institution: Jawaharlal Nehru Center for ASR
• [Journal Article] Multifunctional human transcriptional coactivator protein PC4 is a substrate of Aurora kinases and activates the Aurora enzymes. (2016)
  • Author(s): Dhanasekaran, K., Kumari, S., Boopathi, R., Shima, H., Swaminathan, A., Bachu, M., Ranga, U., Igarashi, K., and Kundu, T.K.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 283 Pages: 268-285
  • DOI: 10.1111/febs.13653.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The transcription factor Bach2 is phosphorylated at multiple sites in murine B cells but a single site prevents its nuclear localization. (2016)
  • Author(s): Ando, R., Shima, H., Tamahara, T., Sato, Y., Watanabe-Matsui, M., Kato, H., Sax, N., Motohashi, H., Taguchi, K., Yamamoto, M., Nio, M., Maeda, T., Ochiai, K., Muto, A., and Igarashi, K.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 291 Pages: 1826-1840
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.661702.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Epigenetic regulation of the Blimp-1 gene in B cells involves Bach2 and histone deacetylase 3. (2016)
  • Author(s): Tanaka, H., Muto, A., Shima, H., Katoh, Y., Sax, N., Tajima, S., Brydun, A., Ikura, T., Yoshizawa, N., Masai, H., Hoshikawa, Y., Noda, T., Nio, M., Ochiai, K. and Igarashi, K.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 291 Pages: 6316-6330
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.713842.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Heme binds to an intrinsically disordered region of Bach2 and alters its conformation. (2015)
  • Author(s): Watanabe-Matsui, M., Matsumoto, T., Matsui, T., Ikeda-Saito, M., Muto, A., Murayama, K., and Igarashi, K.
  • Journal Title: Arch Biochem Biophys. Volume: 565 Pages: 25-31
  • DOI: 10.1016/j.abb.2014.11.005.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Heme regulates protein-protein interaction of transcription factor Bach2 (2015)
  • Author(s): Miki Matsui, Kazutaka Murayama, Toshitaka Matsui, Masao Ikeda-Saito, Kazuhiko Igarash.
  • Organizer: 2015環太平洋国際化学会議（PACIFICHEM2015)
  • Place of Presentation: ハワイコンベンションセンター（アメリカ）
  • Year and Date: 2015-12-15 – 2015-12-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ヘムによる新たなタンパク質制御機構とその生理学的意義 (2015)
  • Author(s): 松井美紀
  • Organizer: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会合同大会）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Roles of Bach2 in the function of alveolar macrophages (2015)
  • Author(s): Risa-Ebina-Shibuya
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Charge-state-distribution analysis of Bach2 intrinsically disordered heme binding region (2015)
  • Author(s): 末永知史, 渡部-松井美紀, 島弘季, 五十嵐和彦, 村山和隆
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13
• [Presentation] ヘムは天然変性タンパク質Bach2のタンパク質間相互作用を制御する (2015)
  • Author(s): 渡部-松井美紀, 島弘季, 五十嵐和彦, 村山和隆
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学学会
  • Place of Presentation: 徳島市あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24
• [Remarks] 東北大学大学院医学系研究科生物化学分野ホームページ
  • URL: http://www.biochem.med.tohoku.ac.jp/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 抗リン酸化Bach2抗体および抗腫瘍免疫活性化剤のスクリーニング方法 (2015)
  • Inventor(s): 五十嵐和彦、武藤、落合、島、安藤、佐藤（好）、玉原、佐藤（勇）
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人東北大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2015-219945
  • Filing Date: 2015-11-09