2017 Fiscal Year Annual Research Report
Discovery of novel Nav1.7 inhibitors by using bioinformatics
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15H02562
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
川真田 樹人 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (90315523)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 充彦 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (10263237)
上園 保仁 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (20213340)
石田 高志 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (60531952)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 無痛症 / ナトリウムチャネル1.7 / 遺伝子変異 / ノックインマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Nav1.7の遺伝子であるSCN9Aのミスセンス変異によるNav1.7の1塩基変異により、無痛症を発症した長野県の家系を発見した。この変異をもとに、H29年度の研究目標は、①本Nav1.7の変異をトランスフェクションした細胞全体に発現するNav1.7と膜に発現するNav1.7の定量を、野生型と変異型で行い、②本Nav1.7変異を導入したマウスを作成し行動生理を行うことである。
まず変異遺伝子をトランスフェクションした細胞全体に発現するNav1.7を定量するため、ウェスタンブロット法を用いて行なったが、細胞全体のNav1.7発現は野生型と変異型で有意差はなかった。そこでNav1.7抗体を用いた免疫染色により細胞内の部位別における、詳細な定量化の検討を試みたが、市販のNav1.7抗体では定量比較に耐えうるだけの十分な蛍光強度が得られず、確認が困難であった。そこで、ビオチン化して膜に発現したNav1.7をウエスタンブロット法で定量したところ、変異型では膜に発現しているNav1.7gは有意に低下していた。
一方、メイティングが成功しなかった変異をノックインしたマウスであったが、ようやく繁殖に成功し、行動研究を行なっうことができた。まず体重増加など、発達に関しては野生型もノックインマウスも差がなかった。時間当たりの歩行距離にも有意差はなかった。熱性侵害刺激に対する逃避時間がノックインマウスで軽度延長していたが、有意差を認めないため、次年度には別の熱性刺激を行うこととした。一方、機械的侵害刺激に対する逃避潜時は延長していること予備実験では確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Nav1.7の遺伝子であるSCN9Aのミスセンス変異によるNav1.7の1塩基変異により、無痛症を発症した長野県の家系を発見した。この変異をもとに、H29年度の研究目標は①本Nav1.7の変異をトランスフェクションした細胞全体に発現するNav1.7と膜に発現するNav1.7の定量を、野生型と変異型で行い、②本Nav1.7変異を導入したマウスを作成し行動生理を行うことである。①に関して膜に発現するNav1.7が変異型で低下していることが示された。②については、基本的な行動観察が終了したので、今後、侵害刺激に対する潜時や閾値をより正確に判定する必要があるが、予備実験としては概ねうまく進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトで発見した無痛症の変異遺伝子ノックインマウスの繁殖に成功し、基本的な行動実験の予備実験が終了した。今後は侵害刺激に対する潜時、閾値を検討し、マウスにおいても痛み感受性が低下していることを示す予定である。予備実験ではその傾向が得られており、証明はできると考えられる。一方、行動実験に加えて、ノックインマウスの後根神経節の急性単離で、Nav1.7の特性を検討し、培養細胞におけるトランスフェクションによる発現系での結果と同様の結果が得られることを検討する。
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Research Products
(2 results)
