2016 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロ流体フロー時分割赤外分光光度計の開発と酵素反応の短寿命中間体の解析
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15H03841
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
久保 稔 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90392878)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 時間分解赤外分光 / マイクロ流路フローセル / 一酸化窒素還元酵素 / ポンププローブ法 / 蛋白質 / 超精密計測 / 高性能レーザー / 生物物理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、高輝度のフェムト秒赤外レーザーを光源に用いて、いまだ困難とされるフロー型の時間分解赤外分光装置を開発し、酵素反応の観測に応用することである。装置の第一の応用として、一酸化窒素還元酵素（NOR）の酵素反応を追跡し、反応機構を解明する。
1年目にフローフラッシュ測定装置を開発し、ケージドNOを反応トリガーに用いた反応系で、脱窒菌cNORのNO結合型中間体の観測に成功している。そこで2年目となる本年度は、NO結合型中間体の生成・消滅の時間変化を追跡するとともに、NO結合型中間体の次に現れるNO還元過程の中間体の観測を試みた。理論的には、2分子のNO間でN-N結合が形成されたhyponitrite（N2O22-）中間体の生成が示唆されている。しかし、我々の反応系ではNO結合型中間体の生成後は速やかにN2Oが生成し、NO還元過程を詳細に解析することができなかった。そこでプロトン輸送経路上のアミノ酸残基を置換した変異体（E57A）を調製し、反応速度を制御することで、NO還元反応の途中に現れる不安定な活性種の捕捉を目指した。E57AのNO還元活性はWTと比べて10%程度であった。今後はこの変異体の反応速度論解析を行う計画である。
また本年度はフローフラッシュ測定装置を、脱窒カビNOR（P450nor）にも応用した。cNORと同様にケージドNOを反応トリガーに用いて、NO結合型中間体およびそれに続く中間体I（NO結合型がNADHによって2電子還元された中間体）の観測に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
cNORのhyponitrite中間体はまだ観測されていないものの、変異体の調製まではできており、来年度に繋げられたため。またcNOR以外にもP450norへと応用範囲が拡がり、研究が発展的に進んだため。
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| Strategy for Future Research Activity |
cNORのE57A変異体を用いてNO還元過程の中間体（hyponitrite中間体など）の観測を目指す。またP450norについては、重水中でも酵素反応を観測し、NO伸縮振動の波数から中間体Iのプロトン化状態を明らかにする。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] A study of the dynamics of the heme pocket and C-helix in CooA upon CO dissociation using time-resolved visible and UV resonance Raman spectroscopy.2016
Author(s)
Otomo, A., Ishikawa, H., Mizuno, M., Kimura, T., Kubo, M., Shiro, Y., Aono, S., Mizutani, Y.
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Journal Title
J. Phys. Chem. B
Volume: 120
Pages: 7836-7843.
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Kinetic analysis of the NO reduction reaction of nitric oxide reductase using nanoliter-flow time-resolved visible/IR spectroscopy.2016
Author(s)
Takeda, H., Kimura, T., Ishii, S., Tosha, T., Shiro, Y., Kubo, M.
Organizer
The 4th International Symposium for Young Chemists on Stimuli-Responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules.
Place of Presentation
大阪大学吹田キャンパス サントリーメモリアルホール（吹田市山田丘）
Year and Date
2016-12-12 – 2016-12-12
Int'l Joint Research
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[Presentation] Observation of water channel opening upon CO photolysis in cytochrome c oxidase by time-resolved XFEL crystallography and IR spectroscopy.2016
Author(s)
Kubo, M., Shimada, A., Baba, S., Yamashita, K., Hirata, K., Yamamoto, M., Shinzawa-Itoh, K., Tsukihara, T., Ago, H., Yoshikawa, S.
Organizer
The 42nd Naito Conference "In the Vanguard of Structural Biology: Revolutionizing Life Sciences"(ポスター賞受賞)
Place of Presentation
シャトレーゼガトーキングダム（札幌市北区）
Year and Date
2016-10-05 – 2016-10-05
Int'l Joint Research
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