2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a screening technique of protein-protein interaction inhibitors in the cytosolic environment
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15H04190
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
河原 正浩 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (50345097)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 創薬 / 遺伝子 / スクリーニング / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では昨年度までに、受容体チロシンキナーゼであるc-Kitの細胞内ドメインと相互作用を検出したい標的タンパク質2種類をそれぞれ連結したキメラ受容体を構築し、標的タンパク質間相互作用を細胞増殖シグナルにより検出することに成功した。しかし、これまでにc-Kit以外の受容体に適用したことはなかった。また、キメラ受容体は細胞質に発現させていたが、受容体は本来細胞膜に局在しており、膜局在型の方がシグナル伝達強度は強くなる可能性がある。従って、別の受容体を用いる、または膜局在させた方が検出感度は向上する可能性が考えられた。
そこで本年度は、c-Kit以外の受容体として、受容体チロシンキナーゼとは別のファミリーであるタイプIサイトカイン受容体のc-Mplを用いたキメラ受容体を構築し、膜局在シグナルの有無で増殖シグナル伝達能が変化するのかを検証した。標的タンパク質として、合成小分子リガンドAP20187依存的にホモ二量体化するFK506結合タンパク質（FKBP12）のF36V変異体を選び、膜局在シグナルを付加しないもの、N末端側にミリストイル化シグナル配列を付加したもの、およびC末端側にファルネシル化シグナル配列を付加したものの3種類を作製した。これらのキメラ受容体コンストラクトをマウスpro-B細胞株Ba/F3に遺伝子導入し、増殖アッセイを行った結果、膜局在シグナルを付加しないキメラ受容体、およびN末端側にミリストイル化シグナルを付加した受容体を導入した細胞において、リガンドであるAP20187依存的な増殖が見られ、検出感度は膜局在シグナルを付加しない受容体の方が高かった。そこで、生体内に実在する相互作用タンパク質のペアとしてBimペプチドとMcl-1を選び、膜局在シグナルを付加しない受容体としてBa/F3細胞で発現させ、増殖アッセイを行った結果、共発現細胞でのみ細胞増殖が見られたことから、BimペプチドとMcl-1の相互作用も検出することができた。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(16 results)
