2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a technology for in-situ realtime monitoring of underground bacteria
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15H04227
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
菅井 裕一 九州大学, 工学研究院, 准教授 (70333862)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 微生物 / フローサイトメトリー / 油層水 / 地下水 / 散乱光 / 蛍光 / フィルター / バックグラウンド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物を利用した地下資源生産や地下環境修復を、より効率良く実施するためには、その場における目的微生物の増殖状況を速やかに把握することが重要である。そのために、本研究ではこれらの地下微生物利用技術において対象とされる微生物種について、その選択的なin-situリアルタイム検出方法としてフローサイトメトリーの利用について検討を進めている。
前年度の研究により、一部の目的微生物についてはフローサイトメトリーによる前方散乱光、側方散乱光ならびに蛍光の強度パターンから、選択的な検出が可能であることが示された。しかしながら、とりわけ地下資源生産現場で腐食などの生産障害をもたらす地下微生物である硫酸塩還元菌については、他の微生物との判別が困難であるなどの課題が生じた。
そこで平成28年度の研究においては、油層水や地下水等を用いてフローサイトメトリー解析を実施し、目的微生物以外の微生物（雑菌）の各種散乱光および蛍光パターンのデータを蓄積して、目的微生物判別のためのバックグラウンドを確定することを目的とした研究を実施した。
4つの異なる油田で採取した油層水および4つの異なる坑井から採取した地下水について、孔径の異なるフィルターでろ過処理を行ない、各ろ液をフローサイトメトリー解析に供して、フィルター孔径の違いによる散乱光/蛍光パターンの相違を検討した結果、フィルター孔径の違いによってそのパターンが大きく異なることが示された。このことを利用すれば、フローサイトメトリー解析に供する試料を特定の孔径を有するフィルターで前処理することにより、バックグラウンドの散乱光/蛍光パターンを調整することが可能となる。すなわち、目的微生物の散乱光/蛍光パターンと重複しないバックグラウンドの散乱光/蛍光パターンとなるようなフィルターで前処理することにより、より精度の高い目的微生物の選択的検出が可能となることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度の研究において雑菌との判別が困難であった目的微生物（硫酸塩還元菌）の選択的検出性を向上させるため、平成28年度は各種油層水および地下水を採取し、雑菌を含むこれらの水試料をフローサイトメトリー解析に供して、雑菌の前方/側方散乱光強度および蛍光強度のパターンを検討した。このバックグラウンドパターンを目的微生物の各種散乱光/蛍光強度パターンと重複しないように人為的に調整できれば目的微生物の選択的検出が可能となるため、バックグラウンドパターンの調整条件を検討した。
バックグランドパターンを人為的に調整する条件として、フローサイトメトリーのサンプリング点数やゲーティングなどの解析条件の検討や、水試料のろ過などの試料前処理条件の検討を行なった。フローサイトメトリー解析条件を変化させた場合においては、バックグラウンドパターンの劇的な変化は認められず、その人為的な調整は困難であった。一方、水試料の前処理として、孔径0.22～40μmのフィルターを用いてろ過した試料のフローサイトメトリー解析を行なったところ、フィルターの孔径によってバックグラウンドパターンが変化することが認められた。一般的な微生物が透過できる10μm以上の孔径のフィルターであっても、孔径の違いによるパターンの変化が認められたため、雑菌を含む試料に目的微生物（硫酸塩還元菌）を添加して同様にろ過処理した試料をフローサイトメトリー解析に供した結果、添加した硫酸塩還元菌のパターンがバックグラウンドパターンとは重複せずに選択的に検出された。このことから、適切な孔径のフィルターを用いた前処理により、雑菌と目的微生物との精度の良い判別が可能であることが示された。
以上のように、目的微生物の選択的な検出条件を明らかにし、平成29年度以降の実用技術化に向けた研究の基礎データを蓄積することができたため、おおむね順調に進展していると判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究により、課題であった目的微生物の雑菌との高精度な判別手法に一定の成果が得られたため、前述した硫酸塩還元菌以外の各種目的微生物（ヨウ素酸化細菌およびメタン菌）について、選択的検出に有効な孔径のフィルターについて検討する。これにより、各目的微生物の選択的な検出に有効なフィルターが選定された後、フローサイトメトリーの機構を取り込んだ、坑井内に導入可能なサイズのデバイスの設計を行なう。同デバイスは、試料中の懸濁物や油分に加えて目的微生物の選択的検出に有効な孔径のフィルター、送液ポンプ、流量調整弁、レーザー光源、各種散乱光/蛍光検出器、ならびにマイクロフローチップにより構成される。すなわち、試料がフォルターを透過後、送液ポンプにより流量調整弁を介して一定流量でマイクロフローチップに導入され、その流路にレーザー光が照射され、前方散乱光、側方散乱光ならびに蛍光の強度がそれぞれの検出器により測定される。
上述した設計のデバイスを製作するにあたり、本開発デバイスに組み込むマイクロフローチップの最適な内径や流量を決定する。
この試作デバイスを次年度のパイロット試験に用いる試験坑井への適用を想定して、外径60 mmの円筒形ステンレス製ハウジング内に、上述した各機器を配置し本デバイスを構成する。また、本デバイスの制御とデータ通信を行なうためのソフトウェアを市販のプログラミングソフトを用いて構築する。
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Research Products
(4 results)
