ゼブラフィッシュ比較動物学とビーズ技術を用いたサリドマイド催奇性メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04288
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 安藤 秀樹 東京医科大学, 医学部, 准教授 (10251844)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ゼブラフィッシュ / サリドマイド / Cereblon / 催奇性

Outline of Annual Research Achievements

本年度の研究計画では、サリドマイド催奇性に関与すると思われるセレブロン(CRBN)内のサリドマイド結合ポケットに配置される４つのアミノ酸のうちどれが催奇性誘導の核となるアミノ酸かを特定することである。

本研究計画では当初トランスジェニック個体の作成に先立ち試験管内合成したキャップトRNAをインジェクションすることでゼブラフィッシュ胚で変異CRBNを一過的に過剰発現することでサリドマイドへの応答性の変化を観察するというものであったが、一時的な機能発現が胸ヒレ（上肢）形成に与える影響は部分的であったので以下のように安定した遺伝子発現系であるトランスジェニック系統を用いた方法に一本化した。

①ヒト型CRBNのトランスジェニックゼブラフィッシュの作成：（目的）サリドマイド処理により胸ヒレの発達が阻害されることを確認する。（実績）過剰発現実験ではゼブラフィッシュ型・ヒト型ともにサリドマイドにより催奇性を発現した。現在トランスポゾン改変型Tol2ベクターを用いて胸ヒレ特異的プロモーターや内在性CRBNプロモーターで発現するヒト型CRBNをもつトランスジェニック系統を作成中である。
②ヒト型CRBNにマウス型アミノ酸を置換した変異CRBNをもつトランスジェニックゼブラフィッシュの作成：（実績）①と同じ手法によりヒトとマウスで異なる４つのアミノ酸を一つずつヒト型からマウス型に置き換えてトランスジェニック系統を構築中である。①②ともにTol2導入構築は完了した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題の計画ではトランスジェニック個体を用いた解析系に先立ちRNAインジェクションによる一過的過剰発現による検定でヒト型およびマウス型CRBNの機能を迅速に観察するという案があった。この方法は簡便かつ迅速である反面、一過的に過剰発現したCRBNタンパク質が発生が進むにつれ分解・代謝され機能が低下する危険性がある。
そこで、本計画通りに継続的かつ特異的な変異CRBNを催奇性の場である胸ヒレで発現、機能させるために各々の変異CRBN遺伝子を胸ヒレまたはそれを含む領域で安定に発現するトランスジェニック系統を作成中である。各遺伝子には蛍光タンパク質GFPを融合させており、一過的過剰発現でCRBNの機能を保持していることは確認済みである。従って生み出されたトランスジェニック個体ではGFP蛍光で導入した変異CRBNを追跡できる。サリドマイドによる催奇性に関わるCRBN中のアミノ酸はわずかに４つであるので、この方法で作出した個体をサリドマイド処理することで目的のアミノ酸を特定できると予想している。

Strategy for Future Research Activity

①概要と進捗状況で述べた通り、最初のステップではヒト型とマウス型CRBNのハイブリッド変異タンパク質を可視化できるトランスジェニック系統を体系的に作成し、サリドマイド投与による催奇性に関与するアミノ酸を特定する計画である。
②次に同定したヒト特異的、ゼブラフィッシュ特異的、マウス特異的なCRBN 結合タンパク質の内、CRBN によりユビキチン化される基質タンパク質をスクリーンする。
③②で得られたヒト・マウス特異的な基質タンパク質をゼブラフィッシュ胚で過剰発現・ノックダウンし、胸ヒレの発生を解析する。これらの結果を統合して、サリドマイド催奇性の中核的役割を担う分子を限定する。