2017 Fiscal Year Annual Research Report
ゼブラフィッシュ比較動物学とビーズ技術を用いたサリドマイド催奇性メカニズムの解明
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15H04288
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
安藤 秀樹 東京医科大学, 医学部, 准教授 (10251844)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | サリドマイド / 催奇性 / ゼブラフィッシュ / セレブロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悲惨な薬害の歴史を持つサリドマイドは、ヒトやゼブラフィッシュの肢形成に催奇性をもたらす一方でマウスには影響を与えない。本研究ではこれをヒントとし、薬害回避の創薬を最終目標として、サリドマイド催奇性のターゲットであるヒトCereblon (CRBN)・ゼブラフィッシュCRBNとマウスCRBNとの機能の違いを生み出す分子機構の限定を目的とする。
具体的にはサリドマイドが結合するCRBNの結合ポケットを形成する保存されたC末端領域の中のわずかなアミノ酸の違いがヒト・ゼブラフィッシュCRBNとマウスCRBNのサリドマイド感受性の差をもたらしていると仮定する。これらのアミノ酸をヒト・ゼブラフィッシュ型からマウス型に置き換えていくことでサリドマイドに感受性を持たなくなるアミノ酸を限定し、催奇性をもたらす原因となるアミノ酸とそれによるサリドマイド結合ポケットの立体構造への影響を明らかにする。
本年度(平成２９年度)の研究成果：本研究課題ではこれまでにヒト・ゼブラフィッシュCRBNとマウスCRBNのサリドマイド感受性の差をもたらしているアミノ酸が、CRBNのC末端側の各種動物でよく保存されているサリドマイド結合ポケット内に存在する４残基のいずれかであると限定した。
本年度の研究において、これら４アミノ酸を一つずつゼブラフィッシュ型からマウス型に置換したCRBNをゼブラフィッシュで発現させ、サリドマイドに胸ヒレ進展が阻害されないものをスクリーンした。これにより明らかにサリドマイド催奇性に抵抗性を示すアミノ酸を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の進捗状況
本研究課題ではこれまでにヒト・ゼブラフィッシュCRBNとマウスCRBNのサリドマイド感受性の差をもたらしているアミノ酸がCRBNのC末端側の約100アミノ酸に存在することを限定した。
さらにその中でも各種動物でよく保存されているサリドマイド結合ポケット内に存在するTri-Tryptophan pocket周辺の４残基の違いこそ、サリドマイド感受性と直結するものであると決定した。
平成２９年度の研究において、これら４アミノ酸を一つずつゼブラフィッシュ型からマウス型に置換したCRBNをゼブラフィッシュ個体で発現させ、サリドマイドにより胸ヒレが短くならないものをスクリーンした。これにより明らかにサリドマイドに抵抗性を示したアミノ酸を４残基の中から同定した。
この成果で本研究の第一目標は達成されたが、次なるステップとしてこのアミノ酸の置き換えによるCRBN分子内のサリドマイド結合ポケットの立体構造への影響、つまりサリドマイドとCRBNとの結合様式の違いを明らかにする。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度の成果で本研究の第一目標は達成されたが、いずれの結果も受精卵へのRNA注入という変異CRBNの一過的発現実験によるものである。次年度ではこの成果を確実に証明するため、研究代表者が開発した生体内リポフェクション法 (Ando and Okamoto, Mar. Biotechnol., 2006)を用いてゼブラフィッシュ同一胚（受精後２４時間）の胸ヒレ進展予定領域の左側にゼブラフィッシュ型CRBNを、右側にマウス型CRBNを導入し、胸ヒレ進展が明瞭になる受精後３日目に観察し、サリドマイド存在下で右側のみ正常に胸ヒレが進展することを確認する。すなわちマウス型CRBNのサリドマイド抵抗性の同一個体中での検証である。さらに安定した変異CRBNの発現を実現するため、CRISPR-Cas9によるゲノム編集でゼブラフィッシュ内在性のCRBNをノックアウトしマウス型CRBNと交換した系統を確立し、サリドマイド抵抗型ゼブラフィッシュを作成する。
以上のプラットフォームのもと、本研究の最終目標であるこのアミノ酸の置き換えによるCRBN分子内のサリドマイド結合ポケットの立体構造への影響を明らかにする。
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Research Products
(1 results)
