2015 Fiscal Year Annual Research Report
慢性炎症によるDNAメチル化異常誘発の分子機構の解明と制御
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15H04302
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
牛島 俊和 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (90232818)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹内 由佳 (並木由佳) 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (20590417) [Withdrawn]
前田 将宏 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (30738703)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAメチル化異常は慢性炎症等による発がんに極めて重要な役割を果たす。一方で、慢性炎症によるDNAメチル化異常誘発機構の詳細は分かっていない。本研究では、これまでに関与の可能性を示してきたIL-1β, TNF-α及び活性酸素などの炎症関連因子、及び、上皮細胞内でのNF-kβシグナルの活性化とTET3の発現低下に着目し、DNAメチル化異常誘発の分子機構を解明する。
1年目の本年度は、まず、DNAメチル化異常が誘発されうる細胞内環境をもつ細胞について、DNAメチル化異常が誘発され易い領域を作出･同定することで、DNAメチル化異常測定系を確立した。高頻度にDNAメチル化異常をもつ大腸がん細胞株HCT116については、DNA脱メチル化剤で処理、もともとメチル化されていた（即ち、メチル化されやすい）CpGアイランドを非メチル化状態としたクローンを9個得た。また、IL-1受容体, TNF受容体を発現している胃がん細胞株HSC41及びTMK1について、DNAメチル化のpre-markとなるH3K27me3修飾をもつDNA非メチル化領域として、HSC41において20領域、TMK1において103領域を同定した。これらにより、DNAメチル化異常誘発の測定系を確立することができた。
次に、HSC41及びTMK1細胞株を用いて、IL-1β、TNF-α及び活性酸素による処理条件をそれぞれの経路の下流遺伝子の発現を指標として最適化した。また、最適化した条件により細胞株を処理し、DNAメチル化異常誘発を解析した。その結果、TMK1では解析した13領域のうちATL1及びHAND2遺伝子において、HSC41では解析した7領域のうちAPCDD1、PCSK5及びPLCXD3遺伝子において微少ではあるもののDNAメチル化レベルの上昇が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究実施計画として予定していたDNAメチル化異常測定系の確立（細胞株の選定及びDNAメチル化異常を測定する遺伝子の同定）を計画通り完了した。また、確立した測定系を用いて、IL-1β、TNF-α及び活性酸素による処理条件を最適化、一部の遺伝子において微少ではあるがDNAメチル化レベルの上昇を検出することができた。これらの理由から、おおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降は、以下の通り研究を推進する予定である。
（1）DNAメチル化異常誘発時のエピジェネティック制御異常の解明：DNAメチル化異常誘発の最終エフェクターであるDNAメチル基転移酵素DNMT1, 3A, 3Bについては、発現変化、活性変化がないことを確認した。そこで、既に解明したTET3の発現低下のみでDNAメチル化異常が誘発されるのか、やはり、DNAメチル基転移酵素の局在異常などメチル化活性の上昇も必要であるのかを明らかにするため、各DNMTについてChIP-シークエンス法により、DNAメチル化異常が誘発される条件下でのゲノム上の局在変化を解析する。これらにより、本来はDNMTが少ないゲノム領域にDNMTがアクセスしていることの有無を明らかにできる。
（2）炎症シグナルとエピジェネティック制御異常のリンクの解明：NF-kβの活性化や活性酸素曝露の何がTET3の発現抑制を誘導するのか、TET3のプロモーター活性への影響やそのモチーフ解析、RNA-シークエンス解析による炎症シグナルで発現変化する遺伝子の探索等により明らかにする。合わせて、NF-kβの活性化、活性酸素曝露によるEZH2などの他のエピジェネティック関連酵素の活性変化、NF-kβ及びそのサブユニットと結合するクロマチン関連因子の活性変化も検討する。
（3）TETの発現増強等によるDNAメチル化異常誘発の制御：TET遺伝子群をノックアウトし、長期培養によるDNAメチル化異常誘発を観察、慢性炎症によるDNAメチル化異常誘発におけるTET発現の重要性を明らかにする。
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