2018 Fiscal Year Annual Research Report
Recapitulation of life cycle of an animal RNA virus in vitro
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15H04324
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
今高 寛晃 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 試験管内タンパク質合成 / 翻訳 / ＲＮＡウイルス / ウイルスプロテアーゼ / 新生鎖 / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、EMCVウイルスの3Cプロテアーゼがリボソームのどこに結合するのかを決定した。3CプロテアーゼのN末がリボソームとの結合に必要であることが分かっていたので、N-末付近にアンバーコドンを導入した。再構成翻訳システムにて、このコンストラクト（3C-amber-His）を翻訳する際、翻訳停止因子（eRF）を除きpBP-サプレッサーtRNAを加えた。このことにより3CのN末にpBPを導入した。翻訳後、UV照射を行うことによりpBPを活性化し、3Cを付近のRNAやタンパク質と架橋させた。尿素で変性後、ニッケルカラムで3C-架橋物を精製した。この精製産物をゲルで分離後ニトロセルロース膜に転写し、RNase処理により結合に関与していないRNAを分解した。残ったRNAの3’にポリAを付加し、逆転写酵素によりcDNAに変換した。このcDNAをクローニングし配列を決定した。配列解析によると結合RNAは60Sリボソームサブユニットのexpansion segmentの配列を持っていた。expansion segmentは真核細胞のリボソームに特有のRNA配列で、リボソームのコア構造から触覚のように外に飛び出しているRNAである。恐らく、３CはこのRNAに結合して、ウイルス新生鎖を効率よく切断しているものと推測される。
次に、他のウイルスが持つプロテアーゼも同様にリボソーム結合能があるかどうか調べた。すると、近縁ウイルスであるA型肝炎ウイルス、ライノウイルス、そして近縁ではないC肝炎ウイルスのプロテアーゼもリボソーム結合能を持つことがわかった。更に、上記の方法で、C肝炎ウイルスプロテアーゼがリボソームのどこに結合するのかを調べると、やはり、60Sリボソームサブユニットのexpansion segmentであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工細胞とウイルス合成の技術基盤は構築でき、業績も上がってきている。また、更に対象ウイルスを広げることができ、研究は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
３０年度までに、脳心筋炎ウイルス（EMCV）とC型肝炎ウイルス（HCV）の試験管内合成を進めてきた。更に研究対象として日本脳炎ウイルス（JEV）を加える。以下のようにEMCV,HCV, JEV RNAの試験管内複製実験を進める：（１）HCVとJEVのRNAレプリコンコンストラクトを完成させる。（２）HeLa細胞抽出液由来試験管内タンパク質合成系を用いた複製実験（３）ヒト因子由来完全再構成型翻訳システムを用いた複製実験
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Research Products
(20 results)
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[Journal Article] The translation inhibitor Rocaglamide targets a biomolecular cavity between eIF4A and polypurine RNA.2019
Author(s)
Shintaro Iwasaki, Wakana Iwasaki, Mari Takahashi, Ayako Sakamoto, Chiduru Watanabe, Yiichi Shichino, Stephen N. Floor, Koichi Fujiwara, Mari Mito, Kosuke Dodo, Mikiko Sodeoka, Hiroaki Imataka, Teruki Honma, Kaori Furuzawa, Takuhiro Ito and Nicholas T. Ingolia
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Journal Title
Mol.Cell
Volume: 73
Pages: 738-748
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Dom34 mediates targeting of exogenous RNA in the antiviral OAS/RNase L pathway2019
Author(s)
Nogimori, Takuto; Nishiura, Kyutatsu; Kawashima, Sho; Nagai, Takahiro; Oishi, Yuka; Hosoda, Nao; Imataka, Hiroaki; Kitamura, Yoshiaki; Kitade, Yukio; Hoshino, Shin-ichi
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Journal Title
Nucleic Acids Res.
Volume: 47
Pages: 432-449
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] HCV IRES CAPTURES A TRANSLATING 80S RIBOSOME TO HIJACK HOST TRANSLATIONAL MACHINERY2018
Author(s)
Takeshi Yokoyama, Kodai Machida, Tomoaki Shigeta, Madoka Nishimoto, Mari Takahashi, Wakana Iwasaki, Ayako Sakamoto, Mayumi Yonemochi, Hideki Shigematsu, Mikako Shirouzu, Hiroaki Imataka, Takuhiro Ito
Organizer
Cold Spring Harbor Meeting Translational Control
Int'l Joint Research
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