2016 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis of transcriptional repression by SRA, a long non-coding RNA
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15H04339
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
三島 正規 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (70346310)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田岡 万悟 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (60271160)
藤原 俊伸 近畿大学, 薬学部, 教授 (80362804)
河原 行郎 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80542563)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | SRA / ノンコーディングRNA / NMR / CLIP法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
長鎖ノンコーディングRNAの一つであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用して、HDACをリクルートすることで核内受容体による転写を抑制的に制御する。本研究では、SHARP-SRA複合体の構造解析により、SRAによる転写調節の分子機構の解明を目指している。
まず、SHARPのRNA結合ドメインであるRRM234の安定同位体標識とNMRによる解析を行った。RRM234は極めて信号の良いスペクトルを与えた。また、現在までにその機能が未知であるRRM1については、多次元NMR法により立体構造を決定し、その構造の精密化を進めている。RRMドメインは単にRNAに結合するだけのドメインではなく、異種のタンパク質・タンパク質相互作用やRRMドメイン同士の相互作用を担うことも知られていることから、RRM間の相互作用による自己阻害等の可能性を考慮して、RRM同士の相互作用もニ次元NMR法を用いて検証した。
さらに、タンパク質-RNAをクロスリンクさせるCLIP法を用いて、SHARPの標的の再探索を試みた。全長を発現する哺乳類細胞の安定株を用いて、SHARPと標的RNAを免疫沈降により得た。この際、効率のよいHalo-Tagを用いたトラップを行った。免疫沈降した複合体に結合している長いRNAを短い断片にマイルドに分解し、現在、シーケンスを解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SHARPタンパク質側の立体構造解析は、RRM1の立体構造解析やRRM234のNMR解析が行われている。また標的RNAに関しては、ノンコーディングRNAであるXistもSHARPの標的の一つであると考えられることから、CLIP法の専門家である河原行郎教授を分担者に迎え、標的の探索を行いシーケンス段階まで来ている。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
SHARP以外にも、ホモログであるRBM15の関与も考えられることから、RBM15の構造解析にも取り組む。またSHARP-Xist複合体の解析については、研究協力者のSattler教授との共同での解析に取り掛かる。
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