2016 Fiscal Year Annual Research Report
Activation mechanism of ubiquitin ligase parkin by PINK1 and phosphorylated ubiquitin
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15H04342
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
菅瀬 謙治 京都大学, 工学研究科, 准教授 (00300822)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 生物物理 / 分子認識 / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リン酸化ユビキチンは、損傷ミトコンドリア上でユビキチン転移酵素Parkinを活性化させ、マイトファジーを誘導する。PINK1とParkinが常染色体劣性遺伝若年性パーキンソン病の原因蛋白質であることから、リン酸化ユビキチン/PINK1/Parkinのシステムは多くの研究者から注目されている。本研究ではNMRを用いて動的構造の観点からParkinの活性化機構を解明することを目的として実験を行っている。昨年度はLB培地でParkinを調製し、13Cホルムアルデヒドによるリジン側鎖のジメチル化を行い、そのNMRシグナルの変化を指標として動的構造解析を試みた。ジメチル化は問題なくでき、NMRスペクトルも得られたが、問題はParkinが不安定で、時間経過とともに、UBLドメインの後ろのリンカー部分で切断されることが分かった。
一方、動的構造解析で用いるNMR測定法R1rho dispersionの開発を進めた。既存の測定法ではNMRシグナルが混み合っていると、複数のシグナル（残基）の情報が混じって正確に動的構造情報を抽出できない場合がある。そこで、この問題を解決するためのパルス列を組み込み、個々の残基由来のシグナルの動的構造情報を既存の測定法よりも正確に測定できる新しい測定法を確立した（J Biomol NMR, in press）。また、この測定法に関して、測定すべきデータをスクリーニングし、かつ測定データを自動的に解析できるソフトウェアも完成させた（Bioinfomatics)
また昨年度、ITCを用いて行った結合実験に関する論文がJ Biol Chemに受理された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
安定同位体標識したParkinの調製に問題がある。LB培地（非標識培地）とM9培地（安定同位体標識培地）を複数の比率で混合し、発現テストを行ったが、いずれの場合でもParkinが不溶性画分に発現され、問題の解決には至らなかった。解決策は後述。
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| Strategy for Future Research Activity |
近年、human ParkinがM9培地で可溶化画分に発現されることが報告されたため、今年度はhuman Parkinの全長と活性化の留め金であるUBLドメインを欠損したコンストラクト（ドミナントアクティブ体）を調製し、NMR実験に用いる。両者のNMRシグナルの化学シフトの違いや運動性の違いの解析を行う予定である。LB培地で調製したParkinはUBLドメインの後ろで時間経過とともに切断されるため元々、UBLドメインが欠損したコンストラクトは安定に存在することが期待される。
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