2016 Fiscal Year Annual Research Report
P-type pump ; Molecular basis of energy coupling and carcinogenesis caused by defects
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15H04346
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
安田 哲 旭川医科大学, 医学部, 助教 (80749896)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Caポンプ / 構造機能連関 / 能動輸送 / 蛋白構造変化 / 発癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．小胞体CaポンプのCa放出型リン酸化中間体E2Pの構造アナログE2BeF3-について、放出機序と膜脂質－Ca2+ポンプ蛋白間相互作用の役割を研究した。そして放出過程では、細胞質A－Pドメイン間相互作用形成、第2膜貫通へリックス（M2）細胞質領域への結合が逐次的に生起し、それらに共役して内腔側放出路開口と親和性低下が逐次的に生起しCa放出が起こることを解明した。さらに、界面活性剤による膜脂質―Caポンプ蛋白間相互作用の障害はM2と細胞質A,Pドメインの集合直前の中間状態（即ち放出路開口状態）を安定化すること、膜脂質―Caポンプ蛋白間相互作用形成によりCa放出とその後の放出路閉口が生起することを明らかにした。
２．ATP分解に伴う3つの細胞質ドメインの動きを輸送部位に伝えるために主要な役割を担うM2について、その細胞質領域（M2c）と膜貫通領域（M2m）を繋ぐGly105の役割を部位特異的変異と速度論的解析により研究した。そしてグリシン残基の構造的柔軟性が構造変化の伝達に必須であることを解明し輸送のエネルギー共役の仕組みの理解を格段に進めた。
３．Caポンプ作動時の1分子動態を解析するため、蛍光標識したCaポンプ1分子を組み込んだナノディスクを形成・精製して顕微鏡下で1分子蛍光観察に成功し、さらにCa輸送サイクル中のポンプ１分子の動きの解析を進めた。また、脂質の種類を変化させナノディスクを形成し、脂質―ポンプ蛋白間の相互作用の機能的意義を各ステップで明らかにした。
４．SERCA2b遺伝子の4か所の点変異それぞれが発癌原因となること、表現型にはそれぞれで顕著な差がある事を見出し、さらに、詳細な個体解析を進めて論文として公表した。さらに、形質膜CaポンプPMCA2の変異による発癌の機序を理解するため、変異によるポンプ蛋白の発現と機能異常の解析を開始した
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ca輸送におけるエネルギー共役機構の構造的仕組みについて、計画した部位特異的変異と速度論的解析、Ca結合・遊離解析、構造変化の生化学的解析により、理解を格段に深めることができた。特に、A,PドメインとM2間の逐次的相互作用の形成とそれに共役した輸送部位の逐次的変化によるCa輸送過程について、M2上のグリシン残基の構造的柔軟性の意義、M2の二次構造変化（αヘッリクス構造の部分的崩壊と巻戻し、それに伴う長さの変化）の意義、さらに、膜脂質－ポンプ蛋白間相互作用の意義解明は、結晶構造からは予想できないものであり、構造機序の本質的な理解を見出したものであり特筆すべきである。
他方、実際に作動するCaポンプの１分子ダイナミクスを解析するための戦略、即ち特異的蛍光ラベル導入、ポンプ1分子を組み込んだナノディスク形成、そして蛍光顕微鏡による観察に成功し、さらに、各素反応の顕微鏡観察やAFM（原子間顕微鏡観察）などを開始するなど、研究計画を順調に進捗させるのみならず、研究を拡大している。
また、ENU-mutagenesisによるマウスモデル網羅的変異導入により、SERCA2b遺伝子の4か所の点変異が発癌原因となる事、しかも表現型には顕著な差がある事を見出して個体の詳細な病態解析を成果として論文として公表し、発癌機序と病態差異理解に必須の分子レベルの情報を得るための各変異のポンプ蛋白への影響を解明することの重要性を提示できた。さらに、各変異体の機能構造特性、および形質膜Caポンプ（PMCA2）異常による発癌についても同様の解析を開始している。さらに、Flippaseの発現系の構築と速度論的解析にも着手し、新たな知見を得始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Ca輸送におけるエネルギー共役機構（部位特異的変異と速度論的研究）： Aドメインに連結したM３の役割とその構造機序を、部位特異的置換と長さを改変した変異体を作成し、速度論、Ca結合・遊離、および構造について解析して明らかにし、輸送の構造機序の理解をさらに進める。他方、E1PCa2を捕捉する化学修飾を利用し、その安定構造アナログ（E1Ca2BeF3-）を形成し、構造・機能特性を解析すると共に、結晶化可能にするための安定化因子検索を引き続き実施して、結晶構造解明に資し輸送機構の分子機序理解をさらに進める。
２．1分子ダイナミクスによるポンプ作動時の1分子動態観察： 特異的蛍光標識法精査、ナノディスク利用を含めた観察面への固定技術精査・開発、動態および機能解析装置の改良による解析をさらに進めると共に、AFMによる解析も進める。他方、ナノディスクを利用してCaポンプ蛋白と脂質相互作用の解析によるCa輸送および速度における脂質の役割についての解析を継続するとともに、単粒子解析も行いポンプ作動中の分子動態を解析する。
３．P型ATPaseメンバーの機能及び作動機構解明： フリッパーゼのATP分解と脂質輸送を速度論的に解析し、輸送とその制御の機構を解明する。
４．発癌機序： 発癌原因となるSERCA2bおよびPMCA2の各遺伝子変異が蛋白の発現と機能へ与える影響を明らかにして、発癌機序と各変異で大きく異なる病態発症機序理解のための分子基盤を確立する研究を引き続き展開し深める。
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[Journal Article] Novel allelic mutations in murine Serca2 induce differential development of squamous cell tumors2016
Author(s)
Hideaki Toki, Osamu Minowa, Maki Inoue, Hiromi Motegi, Yuko Karashima, Ami Ikeda, Hideki Kaneda, Yoshiyuki Sakuraba, Yuriko Saiki, Shigeharu Wakana, Hiroshi Suzuki, Yoichi Gondo, Toshihiko Shiroishi, and Tetsuo Noda
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 476
Pages: 175-182
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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