繋留複合体とSNARE複合体の連動による小胞輸送の調節

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04370
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (40192679)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 細胞・組織 / 細胞内タンパク質輸送 / タンパク質複合体

Outline of Annual Research Achievements

小胞輸送の最終ステップで起こる小胞膜と標的膜（エキソサートーシスの場合には細胞膜）の融合の特異性は、SNAREタンパク質の組合せによって決定されるというSNARE仮説が提唱されている。しかしこれまでの私たちの研究によれば、SNAREタンパク質間の認識は予想よりもはるかに曖昧であり、このような組合せだけで膜融合の特異性が決定されるとは考えにくい。一方、私たちは最近、小胞輸送の際に、繋留複合体のExocystがSNAREタンパク質と相互作用することによって、膜融合の特異性を決定する可能性を示すデータを得た。
平成27年度には、私たちが新たに開発したタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ；Visible Immunoprecipitation Assay）を活用して、８つのサブユニットからなるExocyst複合体の複雑な構築様式を解明した。さらに、VIPアッセイを用いて、SNAREタンパク質のうちのSNAP-23とSNAP-25が、Exocyst複合体のサブユニットのうちのSec6とSec8にそれぞれ結合することを見出した。Sec6とSec8はExocyst複合体のうちでコアを形成するサブユニットである。さらに、siRNAを用いたノックダウン実験によって、SNAP-23、SNAP-25、およびこれらが結合する相手方のSNAREタンパク質であるVAMP2が、Exocyst複合体の下流でトランスフェリン受容体のリサイクリングの過程で、リサイクリング小胞と細胞膜の融合の過程を媒介することを証明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

新たに開発したVIPアッセイを活用して、Exocyst繋留複合体の複雑な構築様式を解明するとともに、この複合体のサブユニットのSec6とSec8がSNAREタンパク質のSNAP-23とSNAP-25にそれぞれ結合することを証明した。さらには、SNAP-23、SNAP-25、およびこれらが結合する相手方のSNAREタンパク質であるVAMP2が、Exocyst複合体の下流でトランスフェリン受容体のリサイクリングの過程で、リサイクリング小胞と細胞膜の融合の過程を媒介することを証明した。これらのことから、本研究はおおむね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は次のような研究を行う予定である。
・Exocyst繋留複合体とSNAREタンパク質の相互作用様式の解明
これまでに、VIPアッセイを活用して、SNAREタンパク質のうちのSNAP-23とSNAP-25が、Exocyst複合体のサブユニットのうちのSec6、およびSec8とそれぞれ結合することを見出しているが、本年度は他のSNAREタンパク質のSNAP-29とSNAP-47がExocyst複合体のどのサブユニットと結合すのかをVIPアッセイによって明らかにする。
さらに、私たちが独自に改良したCRISPR/Cas9システムによって、SNAREタンパク質をノックアウトした細胞を樹立し、様々なレスキュー実験を行うことによって、Exocyst複合体とSNAREタンパク質がトランスフェリン受容体のリサイクリング輸送の最終過程において果たす役割の解明を目指す。

Research Products

• [Journal Article] Modulation of primary cilia length by melanin-concentrating hormone receptor 1 (2016)
  • Author(s): Hamamoto, A., Yamato, S., Katoh, Y., Nakayama, K., Yoshimura, K., Takeda, S., Kobayashi, Y. & Saito, Y.
  • Journal Title: Cell. Signal. Volume: 28 Pages: 572-584
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis (2016)
  • Author(s): Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 28 Pages: 572-584
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] GM130 is a parallel tetramer in a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • Author(s): Ishida, R., Yamamoto, A., Nakayama, K., Sohda, M., Misumi, Y., Yasunaga, T. & Nakamura, N.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 282 Pages: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • Author(s): Katoh, Y., Nozaki, S., Hartanto, D., Miyano, R. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • Author(s): Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 290 Pages: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.655191
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-containing recycling vesicles. (2015)
  • Author(s): Kubo, K., Kobayashi, M., Nozaki, S., Yagi, C., Hatsuzawa, K., Katoh, Y., Shin, H.-W., Takahashi, S. & Nakayama, K.
  • Journal Title: Biol. Open Volume: 4 Pages: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] COPI-mediated retrieval of SCAP is crucial for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • Author(s): Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, S., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • Author(s): Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Lipid Res. Volume: 56 Pages: 2151-2157
  • DOI: 10.1194/jlr.M062547
• [Presentation] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • Author(s): 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • Author(s): 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • Author(s): 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による脂質代謝の調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • Author(s): Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • Organizer: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • Place of Presentation: Snowmass Village, Colorado,
  • Year and Date: 2015-07-19 – 2015-07-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • Author(s): 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • Organizer: 第67回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 草津
  • Year and Date: 2015-05-16