2016 Fiscal Year Annual Research Report
Structural determination of oligomeric cellulose synthase complex
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15H04530
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | セルロース合成酵素複合体 / 膜タンパク質 / 酢酸菌 / 構造生物学 / 蛍光免疫顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌のセルロース合成酵素の機能上最小構成単位であるCesAB複合体のタンパク質精製に取り組んだ。前年度までの結果に基づき選抜した、CesAのC末欠損体とCesBの共発現系を試行したが、複合体の解離を抑える条件を見いだすには至らなかった。一方で点変異体導入により大きく構造を欠損させずに機能を欠損させる点変異体を発見し、CesAタンパク質の酵素反応機構に関する情報を得ることに成功した。
またCesAとCesBに加えてCesCとCesDを含む、より完全形に近いCesABCD複合体の発現・精製にとりかかった。構築した発現系を使って大腸菌で発現させたところ、CesA, CesB, CesCは細胞膜に、CesDは細胞膜と細胞質画分の両方に確認された。酢酸菌においても同様の分布パターンを示すことをすでに確認しており、この発現系を実験に使用できると判断し、細胞膜から複合体を可溶化する界面活性剤のスクリーニングを行った。
また上記CesABCD複合体において、各サブユニットの相互位置関係や酢酸菌細胞内での局在（内膜、外膜、細胞質内、ペリプラズム画分、細胞外）について、免疫蛍光顕微鏡法により、A,B,C,D各サブユニットの酢酸菌細胞内局在を調査した。その結果、CesAとCesDについては細胞長軸方向に沿って一直線に並ぶ様子が観察され、酢酸菌細胞に観察されるセルロース合成酵素の規則的配列「ターミナルコンプレックス（Terminal complex, TC）」にCesAとCesDが含まれることが示唆された。この観察結果はCesA（触媒サブユニット）がTC中に存在することを示す初の証拠である。さらに抗体処理に先だって行う前処理の違いが抗体ラベルにおよぼす影響の分析から、CesAは内膜に、CesDは内膜の外側と外膜の内側の領域（ペリプラズム）に存在することを支持するデータを得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
免疫蛍光顕微鏡法を使って、細胞内におけるセルロース合成酵素複合体の構造について情報を得ることができた点では研究は進んだが、構造解析に先立つタンパク質精製については、まだ方法確立への糸口は見つかっていない。タンパク質精製条件の確立が急がれる点で、研究の進捗は「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、CesABCDおよびCesAB複合体の発現・精製条件の最適化を進める。精製条件については、界面活性剤や使用するアフィニティクロマトグラフィー条件など、基本的な条件の最適化を進める。
また本課題の最大の目的はセルロース合成酵素複合体の構造解解析からセルロース合成のメカニズム解明を目指すことだが、進捗状況も考慮に入れて、密度勾配遠心法、免疫沈降法やプルダウン・アッセイなどの生化学的手法を取り入れて、サブユニット間の相互作用や細胞内局在の分析を進める。セルロース合成酵素は複数の分子からなる複合体であることから、個々のサブユニットの立体構造（三次構造）だけでなく、サブユニット間の配置といった四次構造も、セルロース合成機能を理解する上で重要な情報であり、以上の生化学的な解析結果も含めて包括的にセルロース合成酵素複合体の全貌解明を目指す。
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