2015 Fiscal Year Annual Research Report

Molecluar ecological analysis of nitrogen fixation mechanism in the symbiotic microbial community of sweet potato

Research Project

Project/Area Number	15H04620
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	池田成志国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 北海道農業研究センター大規模畑作研究領域, 上級研究員 (20396609)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	関山恭代国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門食品分析研究領域, 主任研究員 (60342804) 菊地淳国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, チームリーダー (00321753) 小林有紀国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 九州沖縄農業研究センター畑作研究領域, 上級研究員 (00729519) 小林晃国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 九州沖縄農業研究センター畑作研究領域, 上級研究員 (90626954) 塔野岡純子佐賀大学, 農学部, 特定研究員 (00713314)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	窒素固定 / サツマイモ / 共生細菌 / NMR / メタボローム解析 / 微生物多様性
Outline of Annual Research Achievements	九州沖縄農研センター・都城研究拠点において、高バイオマス品種（コガネセンガン）と低バイオマス品種（農林１号）を同一圃場で慣行的に栽培し、生育中期に各品種から窒素固定への寄与が大きいと思われる茎と塊根の各試料を採取した。圃場内における環境変動によるバラつきを抑えるため、各品種について、3反復の試験区を設け、各反復区から3個体、1品種あたり合計9個体からのサンプリングを行った。窒素固定細菌群の多様性や組織特異性を明らかにするため、上記の資料について細菌細胞濃縮法を活用して共生細菌群集のDNAを抽出し、得られたDNAを用いて16S rRNA遺伝子を標的としたパイロシークエンシングによる多様性解析を実施した。また、上述の組織と対応する形で、異なる反復区から得られた3個体の高収量性品種の茎、塊根表面、塊根内部の各試料を燐酸バッファー中でホモジナイズし、2重ガーゼでろ過した。得られたろ液を後日の分離培養試験用試料として10%グリセロール溶液に調製し、-80℃に保存した。これらの各試料のグリセロールストックから低栄養培地をもちいて、サツマイモ共生細菌の大量分離培養を行った。培地種類や培養日数、培養条件などの予備実験を行った結果、試料の種類によりR2A培地で1週間から10日の短期の培養条件と1ヶ月程度の比較的長期の培養条件の２つの条件で得られる細菌群を本課題の分析対象とすることとした。今年度は、迅速な課題遂行のため、比較的短期の培養条件で共生細菌の大規模分離培養を行うこととした。以上の条件下で、当該年度の分離株数は、各個体の各試料あたり200株以上の細菌分離を目安として実施し、合計で約1000株の分離株を得た。さらに、上記の微生物多様性解析の試料と対応する形で、NMR分析用の植物組織（茎、塊根）と土壌のサンプリングを行い、NMR分析のための前処理と予備実験を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 年度末に試料の分析時期が集中したため、微生物多様性解析における共生細菌群集DNA調整に必須の超遠心機が故障したため、年度後半の共生細菌群集のメタゲノムDNA調製と多様性解析の作業を年度内に終えることができず、平成28年度に繰り越してフォロー実験を行うことになってしまった。
Strategy for Future Research Activity	平成28年度は、当初の計画のとおりに、年度前半に前年度からの繰り越し作業を優先して平成27年度にサンプリングした試料についての微生物多様性解析を進めることができた。また、平成27年度に引き続き、平成28年度の前半に約1000株の分離菌株を得た。平成28年度後半には、合計約2000株の分離菌コレクションについて全株からのゲノムDNAの抽出を行い、多様性の高いことが知られている16S rRNA遺伝子の前半領域を標的にしたワンパスのダイレクトシークエンシングを行った。さらに、前年度の予備実験条件にもとづき、多様性解析と対応する形で、サツマイモの各組織について、NMRによる代謝物の分析も順次進めた。