2017 Fiscal Year Annual Research Report
選択的オートファジーによる葉緑体のリサイクルと品質管理の分子基盤
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15H04626
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
石田 宏幸 東北大学, 農学研究科, 准教授 (60312625)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧野 周 東北大学, 農学研究科, 教授 (70181617)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | オートファジー / シロイヌナズナ / 葉緑体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光合成を担う葉緑体には窒素の多くが分配されタンパク質として機能している。独立栄養生物である植物にとって、栄養リサイクルやオルガネラ品質管理としての葉緑体の分解は過酷な環境下での生存戦略の一つとして重要な意味を持つ。葉緑体は「選択的オートファジー」により「部分的に」あるいは「丸ごと」液胞に運ばれ分解されるが、その詳細な分子機構は不明である。本研究では、特に葉緑体オートファジーにおける基質選択性に関わる分子実態について検証することを目的に、オートファゴソームマーカーであるATG8と相互作用する因子の同定を進めてきた。これまでの酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングに加えて、今年度は、共免疫沈降法によるATG8と相互作用する因子のスクリーニングを行った。国際共同研究強化の支援により、共免疫沈降されたタンパク質についてLC-MS/MS解析により網羅的に同定した。さらに、オートファゴソームそのものを植物組織から単離する方法について検討した。オートファゴソームや葉緑体を内容成分とするオートファゴソームであるRCBが細胞質に異常蓄積する新奇変異体を材料に、組織の破砕条件、破砕緩衝液の組成、Iodixanolを用いた密度勾配超遠心分画法、抗体磁気ビーズによる免疫分画法、等について、各パラメーターの最適化について検討した。暫定的に確立された単離法を用いて植物オートファゴソームを単離し、共焦点レーザー顕微鏡によりその可視化像を得た。またウエスタンブロッティングにより内容タンパク質の解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
植物オートファゴソームの単離法については、これまで十分な検討がなされておらず、利用できる文献的知見が極めて乏しかった。しかし今年度の検討から、酵母や動物細胞からのオートファゴソームの単離に用いられているIodixanolの密度勾配遠心が、植物にも有効である可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
植物オートファゴソームを単離法については、引き続き改良を重ねる必要があるが、今年度の解析から一定の方向性は得られている。ATG8との相互作用因子をスクリーニングする際、単離オートファゴソームを材料として用いる方が、組織から調製した総タンパク質を用いるよりも、より確かな情報が得られる可能性は高く、今後の進展が期待される。また高純度なオートファゴソームの単離法が確立した際には、オートファゴソームに含まれる基質（内容物）の特異性についての解析にも有効であると考えられる。
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Research Products
(4 results)
