新規蛍光ラベル法の開発と生細胞における膜タンパク質ヘテロオリゴマー検出技術の確立

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04636
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 松崎 勝巳 京都大学, 薬学研究科, 教授 (00201773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 健一 京都大学, 化学研究所, 助教 (70732874)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 蛍光イメージング / 膜タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

(1) βヘアピン型ラベル法
これまでにFmoc固相合成したAlexa568蛍光標識βヘアピン型プローブペプチド（配列：GRWDKTKDKTWTWEDPGKWTWDKTKDKTWEGGG）に結合すると考えられるタグ（配列: GRWTDTDTDTWTWENGKWTWTDTDTDTWEGGG）を用いて細胞環境でのラベルを試みた。N末端にシグナル配列とタグ配列を付加し、C末端に蛍光タンパク質EYFPを融合したβ2AR遺伝子融合体を、CHO-K1細胞に発現させた所、EYFP蛍光が見られたが、細胞膜への局在が弱く、プローブを添加しても染色が見られなかった。タグが細胞表面へ露出していないか、またはタグ―プローブの結合力が十分でない可能性が考えられた。そこで細胞を固定、膜透過処理後した後プローブを添加したが、この場合も染色されなかったため、結合力が十分でないと考えられる。
(2) RNAアプタマー型ラベル法
HIV由来のヘアピン構造を取るRev-response element (RRE) RNAと、RREに結合するアルギニンリッチペプチド間の相互作用に基づく、RNAアプタマー型ラベル法を検討した。RNAプローブ（配列：UCUGGGCGCAGCGCAAGCUGACGGUACAGG）およびQRタグ（配列：ERRERRRERQRNRRK）を用いた。N末端にシグナル配列とQRタグを、C末端にEYFPを導入したβ2AR遺伝子融合体を作成しCHO-K1細胞に発現させた所、　EYFP蛍光が確認されたが、Alexa568標識RNAプローブを添加しても細胞への結合が見られなかった。細胞を固定、膜透過処理後した後プローブを添加すると細胞内染色が見られたことから、タグ―プローブの結合力は強いが細胞表面へのタグの露出が起こっていなかったと考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

生細胞でコイルドコイルラベル法と併用できる新規タグ―プローブラベル法の開発について、研究開始から２種類のペアによる標識を検討した。タグ付加によって標的タンパク質の細胞内局在が大きく変化しうる事、またRNAアプタマー型ラベル法に関してはプローブを細胞内導入すれば細胞質タンパク質の標識法として有用な可能性がある事が判明したが、生細胞膜タンパク質へテロ会合体検出に有用なラベル法をさらに検討する必要がある。これまで検討した手法以外で比較的モデルペプチドでの会合挙動の報告例が多いコラーゲン型ペプチドを中心とした新規標識法を開発する。標識法が確立すれば、ヘテロ会合検出実験は比較的短期間で行うことができる。

Strategy for Future Research Activity

コイルドコイルラベル法と交差性がなく、かつ強いaffinityで相互作用が期待されるペアとして、コラーゲンへテロ三量体型タグ―プローブラベル法の開発を行う。また、既存のコイルドコイルラベル法とは異なる配列のペアも検討する。モデル膜タンパク質としてこれまで同様にβ2AR-EYFPを用い融合タンパク質遺伝子を作製する。また蛍光標識したプローブペプチドをFmoc固相合成する。融合タンパク質の生細胞膜への発現はEYFP蛍光および蛍光リガンドを用いて評価する。細胞膜部分の蛍光強度のプローブ添加濃度依存性から、見かけの解離定数Kdを算出する。十分強い結合力（Kd < 10 nM）かつ既存のコイルドコイルラベル法との交差性がないペアが見つかれば、C末端にEYFPを持たない融合体を作製し、機能確認後、生細胞膜でのヘテロオリゴマー形成を測定する。