霊長類モデルを用いたインフルエンザ感染重症化宿主因子の探索

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04720
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 伊藤 靖 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (90324566)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 椎名 隆 東海大学, 医学部, 講師 (00317744) ; 仲山 美沙子 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (00510306) ; 小笠原 一誠 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (20169163) ; 七戸 新太郎 帯広畜産大学, 畜産学部, 特任助教 (80737148) ; 石垣 宏仁 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (90432301)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: インフルエンザウイルス / 霊長類モデル / サイトカインストーム / ゲノム / 次世代シーケンサー / 病理学 / 免疫学

Outline of Annual Research Achievements

高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させた免疫低下状態のカニクイザルの症状と相関する遺伝子多型を解析した。その結果、ケモカインの１種の遺伝子のエクソン領域に多型が見られた。この多型はアミノ酸置換を伴い、アミノ酸の置換に伴う機能の変化を解析するため、重症型ケモカインと軽症型ケモカインの遺伝子組換えによる合成を試みた。哺乳類細胞で発現するプラスミドベクターに重症型と軽症型ケモカイン遺伝子を組み換え、動物細胞にトランスフェクションした。この培養上清を回収し、組み換えタンパク質を精製した。精製タンパク質をカニクイザルBリンパ球と培養し、細胞内カルシウム流入を測定し、細胞活性化を解析した。しかし、ケモカイン特異的細胞内カルシウム流入は見られなかった。また、大腸菌内でタンパク質を発現するプラスミドベクターを用いて、重症型と軽症型ケモカインの発現を試みたが、ELISAで検出可能なタンパク質の発現は見られなかった。
新たに免疫抑制のない条件で、高病原性鳥インフルエンザウイルスを感染させたカニクイザルのゲノムDNA遺伝子を用いて、症状と相関する遺伝子多型解析を試みた。これまでに発表した論文、免疫抑制状態下でのカニクイザルの免疫反応の結果に基づき、インフルエンザウイルス感染、免疫応答、血液型に関連する遺伝子から545個の候補遺伝子を選出した。これらの遺伝子の約5700個のエクソンを回収するためにsequence capture probeを設計した。次年度にこれらのprobeを用いて、カニクイザルのゲノムDNA遺伝子を増幅後、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定し、遺伝子多型を検索する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

タンパク質発現効率が低いことと発現タンパク質の立体構造が動物生体内と異なる可能性があるので、変異ケモカインタンパク質作製法を人工合成に切り替える。また、細胞機能測定では、細胞内カルシウム流入のような急性期の短期の活性化では差が見られず、他の細胞機能測定法を検討する必要があるため。

Strategy for Future Research Activity

細胞機能測定では、遺伝子転写、タンパク質分泌等の新たな遺伝子発現の差異を解析する予定である。遺伝子多型解析では、重症化と相関する遺伝子多型の解析を進めつつ、カニクイザルの遺伝子診断をあらかじめ行い、症状を予測の上、感染実験を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Potential Risk of Repeated Nasal Vaccination that Induces Allergic Reaction with Mucosal IgE and Airway Eosinophilic Infiltration in Cynomolgus Macaques infected with H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus. (2017)
  • Author(s): Nakayama M, Itoh Y, Shichinohe S, Nakabayashi R, Ishigaki H, Sakoda Y, Le QM, Kawaoka Y, Kida H, Ogasawara K
  • Journal Title: Vaccine Volume: 35 Pages: 1008-1017
  • DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.01.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of pathogenicities of H7 avian influenza viruses via intranasal and conjunctival inoculation in cynomolgus macaques. (2016)
  • Author(s): Shichinohe S, Itoh Y, Nakayama M, Ozaki H, Soda K, Ishigaki H, Okamatsu M, Sakoda Y, Kida H, Ogasawara K
  • Journal Title: Virology Volume: 493 Pages: 31-38
  • DOI: 10.1016/j.virol.2016.03.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Vaccination against H9N2 avian influenza virus reduces bronchus-associated lymphoid tissue formation in cynomolgus macaques after intranasal virus challenge infection. (2016)
  • Author(s): Nakayama M, Ozaki H, Itoh Y, Soda K, Ishigaki H, Okamatsu M, Sakoda Y, Park C-H, Tsuchiya H, Kida H, Ogasawara K
  • Journal Title: Pathology International Volume: 66 Pages: 678-686
  • DOI: 10.1111/pin.12472
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restores immune potential against H5N1 influenza virus. (2016)
  • Author(s): Yasui F, Itoh Y, Ikejiri A, Kitabatake M, Sakaguchi N, Munekata K, Shichinohe S, Hayashi Y, Ishigaki H, Nakayama M, Sakoda Y, Kida H, Ogasawara K, Kohara M
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 37915
  • DOI: 10.1038/srep37915
  • Peer Reviewed
• [Presentation] カニクイザルを用いたインフルエンザワクチンによる免疫記憶に及ぼす免疫抑制剤の影響の解析 (2016)
  • Author(s): 伊藤 靖
  • Organizer: 第105回日本病理学会
• [Presentation] Pathogenicity of highly pathogenic avian influenza virus in a macaque model under an immunosuppressed condition. (2016)
  • Author(s): Yasushi Itoh
  • Organizer: 第４５回日本免疫学会学術集会
• [Remarks] 本研究室より発表した論文の紹介
  • URL: http://www.shiga-med.ac.jp/~hqpatho2/journal_club.html