2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04738
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
片山 和彦 北里大学, 感染制御科学府, 教授 (60342903)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中西 章 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, その他部局等, その他 (60397049)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ノロウイルス / レセプター / ネズミノロウイルス / MNV / ヒトノロウイルス / HuNoV / CD300lf, ld / ヒト腸管オルガノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトに感染するノロウイルス（HuNoV）は、冬型の急性胃腸炎、食中毒の原因ウイルスとして知られている。HuNoVは、感受性を示す培養細胞が無く、基礎的研究に困難を極めている。
我々が開発したノロウイルス（NoV）のリバースジェネティックスシステム（RGS）は、NoVの宿主特異性がレセプター依存的であることを示した（PNAS Sep 23;111(38):E4043-52, 2014.）。MNVを増殖培養可能なRAW細胞の遺伝子を、CRISPR/Cas9システムでランダムにノックアウトした後、MNVを感染させ、生き残った細胞でノックアウトされている遺伝子の配列を調べ、MNVのレセプター分子CD300lf, CD300ldを同定した（PNAS Oct 11;113(41):E6248-E6255, 2016.）。
CD300lf又は、CD300ldを強制発現させたヒト、サル、ネコの細胞株を構築し、MNVを感染させたところ、細胞は全てMNV感受性となった（特願2016-19315）。CD300lf, ld分子のヒトホモログがHuNoVのレセプターである可能性をしらべたが、HuNoVレセプターとしての機能は有さなかった。
HuNoVレセプター分子を検索するため、慶応大学の佐藤らより、ヒト腸管オルガノイドの供与を受け、ヒト腸管オルガノイドを用いたHuNoVの増殖培養を試み、これに成功した（特願2016-163711）。
現在、ヒト腸管オルガノイドに含まれる感受生細胞のラベル、単離を実施している。感受生細胞のラベルには、感染性ウイルスを用いるほか、VLPを特殊な蛍光物質でラベルする手法、GFP等の発現ベクターを内包させたVLPを使用する方法など多角的な方法を用いて、HuNoVのレセプター分子検索を実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度に得られた成果、MNVのレセプター分子CD300lf, CD300ldの同定と株化細胞の作出を特許出願（特願2016-19315）し、論文投稿を行い（PNAS Oct 11;113(41):E6248-E6255, 2016.）パブリッシュした。HuNoVレセプター検索を実施するため、CD300lf, ld分子のヒトホモログがHuNoVのレセプターである可能性をしらべたが、HuNoVレセプターとしての機能は有さなかった。しかし、MNVレセプターがタンパク質性のレセプターであったこと、NoVの宿主特異性がレセプター依存的であることが強く示唆されたため、HuNoVレセプター分子を検索するため、HuNoV感受生細胞の検索を実施した。慶応大学との共同研究により、ヒト腸管オルガノイドを用いたHuNoVの増殖培養を試み、これに成功した（特願2016-163711）。ヒト腸管オルガノイドによるHuNoV培養の成功は、ヒト腸管オルガノイドの中にHuNoV感受性細胞が存在することを示している。ヒト腸管オルガノイドの中の感受生細胞とそれ以外の細胞を分取し、それぞれの遺伝子サブトラクションによってレセプター分子を発見できることを示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、ヒト腸管オルガノイドに含まれる感受生細胞のラベル、セルソーターによる単離を実施している。また、トランスクリプトーム解析によるサブトラクション、cDNAライブラリー作製、網羅的cDNAライブラリーの発現スクリーニングを実施に移行しつつ有る。感受生細胞のラベルには、感染性ウイルスを用いるほか、VLPを特殊な蛍光物質でラベルする手法、GFP等の発現ベクターを内包させたVLPを使用する方法など多角的な方法を用いて、HuNoVのレセプター分子検索を実施する。さらに、腸管オルガノイドへのRGS系の導入をこころみる予定である。RGSにてオルガノイドより、感染性HuNoV粒子を回収可能となれば、自由にHuNoVの遺伝子改変が可能となり、スクリーニングを加速することも可能となる。ただし、腸管オルガノイドの安定培養、供給には、多額の研究費用と施設の整備が必要となる。費用と設備の問題が解決されれば、平成29年度以降の研究期間内にHuNoVレセプター候補分子を得る可能性は高い。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Complete Genome Sequence of a Recombinant GII.P16-GII.4 Norovirus Detected in Kawasaki City, Japan, 2016.2016
Author(s)
Matsushima Y, Shimizu T, Ishikawa M, Komane A, Okabe N, Ryo A, Kimura H, Katayama K, and Shimizu H.
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Journal Title
Genome Announcements
Volume: 4
Pages: e01099-16
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Molecular evolution of the capsid gene in human norovirus genogroup II.2016
Author(s)
Kobayashi M, Matsushima Y, Motoya T, Sakon N, Shigemoto N, Okamoto-Nakagawa R, Nishimura K, Yamashita Y, Kuroda M, Saruki N, Ryo A, Saraya T, Morita Y, Shirabe K, Ishikawa M, Takahashi T, Shinomiya H, Okabe N, Nawasawa K, Suzuki Y, Katayama K, Kimura H.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 7,6
Pages: 29400
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Identification of the functional receptor for murine norovirus2016
Author(s)
Kei Haga, Akira Fujimoto, Yen Hai Doan, Reiko Takai-Todaka, Motohiro Miki, Kosuke Murakami, Masaru Youkoma, Kazuyoshi Murata, Akira Nakanishi and Kazuhiko Katayama.
Organizer
6th international Calicivirus Conference
Place of Presentation
Savannah, GA, USA
Year and Date
2016-10-09 – 2016-10-13
Int'l Joint Research
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