虚血性心疾患における心筋特異的ミオシン軽鎖およびリン酸化の意義とその治療への展開

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H04826
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 北風 政史 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究開発基盤センター, 部長 (20294069)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 瀬口 理 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 医師 (60570869) ; 山崎 悟 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (70348796) ; 朝倉 正紀 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究開発基盤センター, 室長 (80443505) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 循環器・高血圧 / 虚血性心疾患 / 心筋梗塞 / 心筋保護

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者および分担者たちはヒト不全心筋検体の網羅的遺伝子解析により心筋細胞に特異的に発現する心筋型ミオシン軽鎖リン酸化酵素（cardiac-MLCK)を新規に同定した。研究代表者および分担者たちの報告では心筋特異的に発現することに加えて、①心不全重症度に相関してその遺伝子発現は上昇する、②心室型ミオシン調節性軽鎖をリン酸化する、③培養心筋細胞においてサルコメア構造構築に関わる、④ゼブラフィッシュモデルにおける遺伝子発現抑制による心臓発生異常（拡張型心筋症様表現型）が再現される、ことなどを明らかにした。さらに、家族性肥大型心筋症の原因遺伝子としてcardiac-MLCKの基質であるミオシン軽鎖が報告されていることや、研究代表者および分担者たち自身が心筋症の原因遺伝子としてcardiac-MLCKの遺伝子変異を同定していることからはcardiac-MLCKが心臓の形態形成やリモデリングにも関与する可能性があることが示唆されている。これらを背景として心不全の原因疾患として重要な心筋梗塞発症後に起こりうる心臓リモデリングとcardiac-MLCK－ミオシン軽鎖リン酸化シグナルとの関連について以下の解析を行っている。
①培養心筋細胞を用いた低酸素刺激（１％酸素、３０分）に対するミオシン軽鎖リン酸化状態の評価
②RaPIDシステムで同定したcardiac-MLCK特異的結合ペプチドの細胞レベルならびにin vitroでのcardiac-MLCKリン酸化活性への調節効果確認。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①培養心筋細胞を用いた低酸素刺激（１％酸素、３０分）に対するミオシン軽鎖リン酸化状態の評価：現時点で低酸素刺激により起こりうるミオシン軽鎖リン酸化レベルの低下に伴い、サルコメア構造構築についても異常が認められることが示唆されている。またこれら低酸素刺激によるサルコメア構造異常はcardiac-MLCKをアデノ関連ウイルス（AAV9)によるcardiac-MLCKの強制発現系により改善する現象が認められた。本現象に関しては現在再現性の確認を行っており、cardiac-MLCKの発現により、ミオシン軽鎖リン酸化レベルの増加に一致したサルコメア構造異常の表現型がレスキューされるかどうかを確認している。
②cardiac-MLCK特異的結合ペプチドの細胞レベルならびにin vitroでの効果確認：in vitroにおいてcardiac-MLCK抑制効果が確認できた２種類のペプチドについてcardiac-MLCKへの特異性を確認するため、生体内に広く存在し、cardiac-MLCKと高い相同性のリン酸化ドメインを持つsmooth muscle MLCKと骨格筋に局在するskeletal muscle MLCKに対する結合性、効果を評価した。現時点までの結果ではペプチドはcardiac-MLCKに特異的であることが確認された。

Strategy for Future Research Activity

研究計画１．培養心筋細胞を用いた低酸素刺激によるcardiac-MLCKリン酸化シグナルの変化、心筋細胞サルコメア構造変化ならびにcardiac-MLCKタンパク発現によるレスキュー効果については引き続き再現性の確認を行う。また、cardiac-MLCK活性抑制ペプチドについては、細胞内への透過性を確認後、培養細胞へ投与することで低酸素刺激と同様の表現型が得られるかどうかを評価する。さらに小動物心筋梗塞モデルにおけるcardiac-MLCKリン酸化シグナル系の変化については野生型心筋梗塞マウスの作成を行っており、Sham手術マウスを対象として梗塞部位、境界領域、健常領域における病理学的解析とともにcardiac-MLCK遺伝子発現ならびにタンパク発現を評価する。ミオシン軽鎖リン酸化についても評価していく。これらの解析は今後遺伝子改変（cardiac-MLCKノックアウト、cardiac-MLCK-Tg)を用いても同様の研究を実施する予定。
研究計画２．cardiac MLCK特異的活性制御作用を有するペプチドについてはその効果を生化学的に明らかにする。具体的には基質であるミオシン軽鎖およびATPに対するVmax、Kmへの影響を検討し、その作用機序について検討を進める。さらに今後の薬剤合成展開に向けて、cardiac MLCKとペプチドの共結晶構造解析を目指す。その為にcardiac MLCKの大量精製および単分散化に向けたシステムの構築を行っていく。