2015 Fiscal Year Annual Research Report
Nrf2-p62ダブルノックアウトを用いたオートファジー異常による肝発癌の解析
| Project/Area Number |
15H04917
|
|---|
| Research Institution | University of Tsukuba |
|---|
Principal Investigator |
柳川 徹 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10312852)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田渕 克彦 信州大学, 医学部, 教授 (20546767)
蕨 栄治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70396612)
内田 文彦 筑波大学, 附属病院, 医員 (70736008)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | p62 / Nrf2 / 肝細胞癌 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、酸化ストレス防御系の転写因子であるNrf2とp62を掛け合わせたNrf2-p62ダブルノックアウトマウスを用いてNAFLDからNASHを経て肝細胞癌の発症におけるp62の役割を探ることを目的として以下の研究を行った。
【in vitroの解析】 1）酸化傷害の定量化：DCFH-DAによる活性酸素の定量：UVB照射によって細胞傷害を与え、その際のp62(-/-)MEFの酸化ストレスをDCFH-DAとFACSで定量したところ、活性酸素がp62(-/-)MEFでは減少していることが解った。2）アポトーシスシグナルの検討： p62(-/-)MEFで増殖能の異常が知られているため、p62(-/-)MEFとp62をsiRNAでノックダウンした細胞について、Bcl-2ファミリーの異常を調べたところBcl-2の上昇とBAXの低下が認められた。3)ゲノム編集による変異細胞の制作： CRISPR/Casシステムによるゲノム編集を用いてMEF, Raw264.7, Caco-2に対してp62欠損細胞を製作しNASHのセカンドヒットの原因の究明の準備とした。
【in vivoの解析】Nrf2-p62 DKOマウスの準備:Nrf2とp62の単独欠損ノックアウトマウスを交配し、Nrf2(-/-) p62(-/-)ノックアウトマウスを選別し次年度以降の研究の準備をおこなった。
【臨床的探索】免疫染色によるオートファジー因子の臨床サンプルでの発現の確認：肝臓の適切なサンプルの収集が遅れたため、症例のそろっていた口腔扁平上皮癌の臨床検体（70例）を選択し、p62, LC3-A, Bの抗体を用いてLsAB法で染色を行い、臨床検体での発現と、臨床病態（TNM分類、pN、局所再発、後発転移、生存率など）との比較を行ったところ、切除断端の正常組織でのp62の発現が腫瘍の再発と関連していることを見出した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitroの解析の解析は予定より準備状況がよく、アポトーシスの異常についての検討については結果が得られた。また、ゲノム編集も当初の計画と方針を変えて、解析目的に応じて細胞株を選んで順調に進んだ。in vivoの解析は、マウスの交配が進んで、実際の肝臓の異常を検討できるレベルになった。臨床的探索については、肝細胞癌の病理組織の収集が遅れたため、代用の口腔扁平上皮癌での発現を免疫染色で行ったところ、想定外にp62と再発の関連が見出された。以上から、一部計画の変更があったものの，おおむね進捗状況は順調だと考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
アポトーシスの異常については解析が終了し、p62-Nrf2 DKOのマウスの準備も整い、ゲノム編集での細胞の変異の導入についても準備が出来たため、このままの方針で継続すれば結果は得られると考えられている。臨床検体については肝臓のサンプルの収集を行うと同時に、口腔癌のサンプルで得られた知見をさらに解析して行く方針とし、方針としては本年度の延長を若干の方針の変更も交えながら研究を進めていく予定である。
|
Research Products
(4 results)
