2016 Fiscal Year Annual Research Report
運動器疾患に対するエピジェネティック治療標的の探索
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15H04961
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
今井 祐記 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (10423873)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 軟骨 / 分化 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エピゲノム修飾状態は、細胞分裂を経てもなお一部継承される。近年、細胞分裂の際のDNAメチル化維持制御因子であるUhrf1 が、癌細胞増殖などに機能を発揮することが報告されている。しかしながら、骨格組織においてはその役割は全く不明であるため、我々は四肢特異的遺伝子欠損マウスを用いて骨格組織におけるUhrf1の働きについて解析した。
四肢間葉系細胞特異的にCreを発現する(Prx1-Cre)マウスとUhrf1 floxマウスを交配し、四肢間葉系細胞特異的Uhrf1KO（cKO）マウスを作出、解析した。軟X線ではcKO群の四肢長管骨長がControl群に比べ、約３割の著明な短縮を認めた。また、組織学的解析ではcKO群の成長軟骨板細胞の柱状配列に乱れを認め、有意な増殖軟骨の面積の減少および肥大軟骨の幅の増加を認めた。さらに、cKO由来初代培養軟骨細胞では、細胞増殖の低下、アルシアンブルーで染色される軟骨基質の著明な低下を認めた。そこで、軟骨分化マーカー遺伝子発現変動を解析した結果、cKO群では、早期分化マーカーCol2、Col11a1に発現低下傾向を認め、後期分化マーカーCol10、Runx2には発現上昇傾向、さらにMmp13の有意な発現上昇を認めた。このことから、Uhrf1遺伝子欠損により軟骨細胞分化が促進され、成長軟骨板における肥大化が進行した結果、長管骨長の短縮を認めたと考えられた。そこで、Uhrf1欠損により軟骨細胞分化促進に至る責任遺伝子群を同定するため、ゲノムワイドなDNAメチル化変動をMeDIP-seq、遺伝子発現変動をRNA-seqで解析し、二つのゲノムワイドデータの統合的解析を行うため、メチル化DNAの濃縮を行った結果、cKO細胞では濃縮されるメチル化DNA量が有意に減少していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画に沿って、研究成果が得られている。
今年度は、最終的な統合的解析を実施する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２７、２８年度の研究成果から、四肢間葉系幹細胞特異的Uhrf1遺伝子欠損マウスが、全長管骨の短縮のみならず、四肢全体の低形成、骨密度の低下、骨格変形等を来すことを見出した。このことから、本研究を軟骨のみに限定せず、運動器における多くの組織で評価する意味の重要性を考慮し、開始する。
また、樹立したUhrf1遺伝子ノックダウン細胞株での軟骨分化実験では、遺伝子発現低下を認めたものの、細胞株毎にノックダウン効率が大きく異なり、バラツキが非常に大きくなったため、四肢間葉系幹細胞特異的Uhrf1遺伝子欠損マウス由来の初代培養軟骨細胞を用いて、ゲノムワイド解析を行う。Uhrf1の主な分子機能は、その有する複数の機能ドメインからDNAメチル化による遺伝子発現制御に関与しているため、軟骨細胞におけるUhrf1標的遺伝子を探索する。そのために、
①RNA-seqによる遺伝子発現プロファイル
②メチル化DNAシーケンス（MeDIP-seq）
を、分化前後の細胞を用いて、当施設内の次世代シーケンサおよび共同研究により、ゲノムワイドデータの統合的解析を実施する。統合的解析の結果から、同定しえた複数の候補因子について、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子発現抑制の後に、細胞増殖実験や軟骨分化実験を行い、軟骨基質産生能をアルシアンブルー染色により、軟骨分化マーカーの遺伝子発現変動を定量的RT-PCR法により、その機能評価を行う。またプロモーター領域のDNAメチル化をバイサルファイトシーケンスにて評価する。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] The CUL3-SPOP-DAXX axis is a novel regulator of VEGFR2 expression in vascular endothelial cells2017
Author(s)
Sakaue T, Sakakibara I, Fujisaki A, Uesugi T, Nakashiro K, Hamakawa H, Kubota E, Joh T, Imai Y, Izutani H, Higashiyama S.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 7
Pages: 42845
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Identification of Nedd9 as a TGF-β-Smad2/3 Target Gene Involved in RANKL-Induced Osteoclastogenesis by Comprehensive Analysis2016
Author(s)
Omata Y, Nakamura S, Koyama T, Yasui T, Hirose J, Izawa N, Matsumoto T, Imai Y, Seo S, Kurokawa M, Tsutsumi S, Kadono Y, Morimoto C, Aburatani H, Miyamoto T, Tanaka S.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 11
Pages: e0157992
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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