2016 Fiscal Year Annual Research Report
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15H04995
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
石橋 達朗 九州大学, 大学病院, 病院長 (30150428)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 康博 九州大学, 医学研究院, 准教授 (20380389)
星野 友 九州大学, 工学研究院, 准教授 (40554689)
吉田 茂生 九州大学, 医学研究院, 准教授 (50363370)
中尾 新太郎 九州大学, 大学病院, 講師 (50583027)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リパスジル / 網膜血管新生 / 血管透過性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
In vitroで、ヒト網膜微小血管内皮細胞（HRMEC）をリパスジルで前処理し、次いでVEGFで刺激した。 ROCK活性は、MYPT-1のリン酸化によって評価した。網膜におけるリパスジルの濃度は、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS/MS)によって測定した。In vivoでは、正常食塩水、0.4％、または0.8％リパスジルを虚血網膜血管新生モデル（OIR）マウスあるいはVEGF強制発現マウスに1日3回投与した。出生後（P）15、P17、またはP21に網膜フラットマウントで血管新生および無血管網膜領域を定量した。網膜低酸素領域を、P17で免疫組織化学により低酸素感受性薬剤ピモニダゾールを用いて評価した。血管の正常化はP17の免疫組織化学によっても評価した。
リパスジルは、30μmol/LのHRMECにおけるVEGF誘導MYPT-1のリン酸化を有意に減少させた。リパスジルは、VEGF誘導HRMECの遊走、増殖、血管透過性亢進とクローディン5膜発現を有意に阻害した。網膜におけるリパスジルの濃度は、それぞれ0.4％および0.8％のリパスジル処置の後、3.8-10.4μmol/Lおよび6.8-14.8μmol/Lであった。 0.4％および0.8％のリパスジル処置OIRマウスでは、P17およびP21の生理食塩水処置マウスのものと比較して、血管新生および網膜の無血管領域の面積が有意に減少した。VEGF強制発現マウスにおいて蛍光造影検査での透過性促進が抑制され、光干渉断層計における網膜浮腫が抑制されることを観察した。ピモニダゾール染色は、0.4％および0.8％リパスジルでの処置が生理食塩水と比較して低酸素領域の増加を有意に阻害することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
選択的ROCK阻害剤（リパスジル）が、VEGF強制発現マウスでおけるの蛍光造影検査での透過性促進が抑制され、光干渉断層計における網膜浮腫が抑制されることを観察できた。液体クロマトグラフィー質量分析法を用いて、リパスジル点眼後に薬剤が網膜と脈絡膜にて薬剤濃度が上昇することを確認できた。さらにin vitroにおいて網膜血管内皮細胞を用いた。VEGFにより誘導される血管透過性亢進とクローディン5膜発現をリパスジルにより有意に抑制することを観察した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)テネイシンC標的プラスチック抗体の最適化と網膜血管新生抑制効果の検討：タンパク質認識プラスチック抗体調製法を用いて組み換えテネイシンCに強く結合するナノ粒子(プラスチック抗体)の2次スクリーニングを行う。既に合成した高分子ナノ粒子ライブラリーからテネイシンCタンパク質に結合する高分子ナノ粒子をELISA法でスクリーニングし、必要な機能性モノマーの混合比を決定する。次に、標的タンパク質とインテグリン受容体との結合に重要だと考えられているアミノ酸配列のペプチドエピトープを用いて鋳型重合およびアフィニティー精製を行う。培養ヒト網膜血管内皮細胞(HREC)アッセイ系において、テネイシンＣ依存性の増殖能、遊走能、管腔形成の亢進に対する、最適ナノ粒子(テネイシンC標的プラスチック抗体)の抑制効果を指標に、至適濃度を選定する。最適ナノ粒子の血管新生抑制効果を、既に確立しているマウス酸素負荷網膜血管新生モデルを用いて検証する。
(2)ROCK阻害点眼薬のDME抑制効果の検討：VEGF強制発現マウス(Kimbaマウス)における血管新生をリパスジルにより抑制できるかを検討する。さらには以前、われわれは網膜血管新生にマクロファージ、特にM2マクロファージの関与を報告した。そのため、リパスジルのM1M2マクロファージ分画への影響について、フローサートメトリーと免疫染色法を用いて検討を行う。
(3)国産遺伝子治療技術を応用したDMEに対する神経保護遺伝子治療法開発の基盤作成：Akimbaマウス4週齢の片眼に、1.0x106-2.5x108 TU/mlのSIV-hPEDFを網膜下投与し、投与後4週（8週齢）までの網膜厚をOCTで経時的に評価し、投与後4週ならびに8週で眼球を摘出し、病理組織的検討を実施する。さらに、治療効果と網膜ならびに全身への影響を考慮し、ベクターの至適濃度を決定する。
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Research Products
(8 results)
