郭清術後のリンパ組織再構築術～悪性黒色腫予後の改善を目指して！

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H05001
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 古川 洋志 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00399924)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 利彦 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (00432146) ; 舟山 恵美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10533630) ; 七戸 龍司 北海道大学, 大学病院, その他 (30640346) ; 山本 有平 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70271674) ; 小山 明彦 北海道大学, 大学病院, 講師 (70374486) ; 村尾 尚規 北海道大学, 大学病院, 助教 (90706558) ; 関堂 充 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40372255)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 組織培養・移植学 / 悪性黒色腫 / 予後改善 / 郭清術 / リンパ組織再構築

Outline of Annual Research Achievements

郭清術後のリンパ組織再構築を目指す為に、まずは膝窩リンパ節を切除しない群(sham群)/膝窩リンパ節を切除した群(郭清群)/膝窩リンパ節切除後にリンパ節移植した群(リンパ組織再構築群)のモデルを作成した。マウスにおける膝窩レベルでのリンパ節切除は人間での郭清に相当する為にリンパ浮腫を呈する。2%evans blue色素をマウスのfoot padに20μl皮下注射し，リンパ組織再構築の程度によって色素の回収率が異なるかどうかを採血を行い、吸光度で測定した。この結果、術後早期では郭清群・リンパ組織再構築群では吸光度が低かったが、時間の経過とともに吸光度はsham群レベルまで回復した。またICGを用いて蛍光造影を行なった。sham群と比較して郭清群・リンパ組織再構築群ではICGの鬱滞を早期には呈していたが時間の経過とともに鬱滞は改善し、吸光度の回復と相関した。術後3週間で郭清群では膝窩リンパ節がうつらないリンパ流の回復が、一方リンパ組織再構築群では膝窩リンパ節がうつっているリンパ流の回復が確認できた。また移植したリンパ節を評価する為にLYVE-1,CD3での免疫組織学的染色を行い、Tリンパ球の局在、リンパ管内皮の構築を確認した。これらの所見から郭清術後にリンパ節を移植する事で、リンパ節の機能を温存したリンパ組織再構築が行われた可能性が示唆された。そして、本モデルにルシフェラーゼ遺伝子を導入した悪性黒色種細胞をfood padに移植して現在解析をすすめている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

リンパ浮腫を呈する郭清モデル、リンパ再構築も出るを含めた各種動物モデルを作成できた。モデル作成にはマイクロサージャリーによる手技が必要であるが、安定したモデル作成が可能となった。さらにその動物モデルを用いてリンパ節の生着を確認し、リンパの機能についても評価できた。これらの動物モデルに対して、培養したルシフェリン遺伝子導入を行った悪性黒色腫の細胞を移植した。よって研究はおおむね順調に伸展していると思われる。

Strategy for Future Research Activity

移植した悪性黒色腫細胞を用いてリンパ組織再構築手術による転移・生命予後に対する影響を検討していく。ルシフェラーゼアッセイにより肺転移すサイズの評価を行い、モデル間での比較する。また各種リンパ節を採取し同様に転移の定量化を行い、モデル間での差を比較する。また腫瘍免疫の解明の為に、悪性黒色腫移植によるリンパ節の影響を免疫組織学的染色で評価する。IL-2, IL-10,Foxp3,TNF-α,TGF-βなどのサイトカインをPCRで定量化していく。