2015 Fiscal Year Annual Research Report
癌転移機構解明に向けた近赤外発光・電顕併用白金ナノプローブと生体ナノ計測法の開発
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15H05354
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| Research Institution | Kure National College of Technology |
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Principal Investigator |
田中 慎一 呉工業高等専門学校, 自然科学系分野, 准教授 (30455357)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 近赤外光 / 白金ナノクラスター / 光化学 / 癌診断 / 生物物理 / 生体イメージング / １分子計測 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体適合性の高い近赤外領域に蛍光特性を有する白金ナノクラスターの合成とその光学特性評価について実施した。近赤外蛍光性白金ナノクラスターの合成は、還元性アミン系化合物であるPAMAM Dendrimerを鋳型分子として用いて行った。まず、鋳型分子であるPAMAM Dendrimerと金属（白金）イオンを低温化で反応させ、還元反応によってPAMAM Dendrimer内に白金ナノクラスターを生成させた。白金ナノクラスターの合成後、超遠心分離機及び近赤外蛍光検出器を備えた高速液体クロマトグラフ（HPLC）を使用して不純物を取り除き白金ナノクラスターの単離・精製を行った。合成した白金ナノクラスターは発光波長：600～650 nm、量子収率：約1.0%、粒径：1.1～1.5 nmであり、ナノサイズでかつ近赤外領域に高い蛍光特性を有することが明らかとなった。さらに、細胞毒性試験を実施し、細胞毒性が低いことも確認した。
白金ナノクラスターを利用した生体分子修飾法を構築するために、アミン化合物を使用してリガンド交換を行いPAMAM Dendrimer内から白金ナノクラスターを取り出した。続いて、これらアミン化合物のカルボキシル基と乳癌細胞（KPL-4）に特異的に結合するHerceptin (HER2)抗体のアミノ基との間でカップリング反応を行い、白金ナノクラスター蛍光プローブを調製した。
続いて、白金ナノクラスター蛍光プローブを乳癌細胞（KPL-4）へ投与し蛍光観察を実施した。その結果、細胞から蛍光が観察された。さらに、合成した白金ナノクラスターを体毛を持たないヘアレスマウスの皮下に投与しin vivoイメージングを行ったところ、マウスの皮下3 mmから600～700 nmの蛍光が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究計画は近赤外蛍光性白金ナノクラスターの開発とその光学特性評価及び電子顕微鏡観察であり、主に金属ナノクラスターの合成・評価と生細胞観察について実施してきた。
今年度の研究成果として、赤色（600～650 nm）から少量ながら近赤外（700～750 nm）領域に蛍光特性を有する白金ナノクラスターの合成に成功しただけでなく、走査透過型電子顕微鏡（STEM）を用いてその粒子径（1.1～1.5 nm）と原子レベルで結晶構造について評価できたため、当初の予定をおおむね達成している。また、白金ナノクラスターの原子レベルでの画像化についてはこれまでにほとんど報告されていないため、本研究で初めて得られた知見である。さらに、細胞毒性についても評価し、生体プローブとしての有用性も確認できているだけでなく、次年度以降の計画である白金ナノクラスターを用いた生体分子への修飾方法の検討及び生細胞観察についても実施している。
しかしながら、合成した白金ナノクラスターの量子収率は１％程度と低く、モデルマウスを用いた癌診断へ応用するためには、量子収率を５％程度にまで改良する必要がある。さらに、HER2抗体やPAR1抗体などの生体高分子で標識する際に、静電的な相互作用によって凝集してしまい生理活性を失ってしまう。そのため、活性を維持した生体分子プローブを形成させるためには白金ナノクラスターの表面を修飾する分子の選択も含めて実験条件について検討する必要がある。
現在までの進歩状況については白金ナノクラスターの発光効率と生体分子への修飾条件について改良の必要性があるが、当初の予定である近赤外発光性の白金ナノクラスターの合成とSTEMを用いた分子構造評価について達成できているためおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策は（１）白金ナノクラスターの発光効率の改良、（２）白金ナノクラスターを用いた生体分子修飾法の確立である。
（１）白金ナノクラスターの発光効率の改良：白金ナノクラスターは微細な金属結晶であるだけでなく、その表面が疎水性であるため、水溶液中で不安定であるだけでなくPAMAM dendrimerから取り出す際にお互いに凝集し光学活性を失ってしまう。そこで、白金に親和性があり内部が疎水性でかつ外部が親水性であるミセル分子を用いてリガンド交換を行うことで、白金ナノクラスターが凝集することなく安定に生理食塩中に分散できるようにする。さらに、疎水性のミセルを用いることで、白金ナノクラスターの光学特性も保持できるため、白金ナノクラスターの量子収率も２から３倍改良させることが期待できる。そこで、白金ナノクラスターの発光効率を向上させるために、白金ナノクラスターを包埋させる分子ミセルの選択及び実験条件について検討する。
（２）白金ナノクラスターを用いた生体分子修飾法の確立：抗体を用いた白金ナノクラスター分子プローブを調整するために、抗体の活性を維持した分子修飾法について検討する。そこで、本研究ではアダプタータンパク質としてProteinAを用いる。今年度中にすでにProteinAを用いた白金ナノクラスターの分子修飾について試しており、高い反応効率でProteinAと白金ナノクラスターを結合させることに成功している。そこで、抗体と反応させる際に、凝集体を形成し生理活性を失わないよう、白金ナノクラスターとProteinAやHER2との反応割合や白金ナノクラスターの表面状態も含めてHER2やPAR1抗体が凝集しない実験条件について検討し最適化する。
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Research Products
(4 results)
