2017 Fiscal Year Annual Research Report
人工結合タンパク質を基盤としたプライベートシャペロンシステムの再構築
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15H05370
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
安井 典久 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (90467514)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 進化分子工学 / 合成生物学 / 分子シャペロン / 単鎖モネリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，プライベートシャペロンのフォールド特異的な基質タンパク質認識と，分子シャペロン機能の相関関係を明確にすることを目的に，人工結合タンパク質作製基盤の構築と，それを起点とした合成生物学的研究に取り組む。昨年度において，人工結合タンパク質の分子骨格として，Chitinase A1のキチン結合ドメイン， 単鎖モネリンおよびKeap-1のKelch repeatドメインの3種類を用い，ファージディスプレイライブラリーの作製とライブラリーの選別に取り組んだが，良好なライブラリーを作製するには至っていなかった。本年度においては，人工結合タンパク質の分子骨格として，特に単鎖モネリンに着目し，研究を行った。
単鎖モネリン中の2本のループのアミノ酸配列を20種類のアミノ酸残基で多様化させたファージディスプレイライブラリーを作製した (ライブラリーサイズ: 約1×10^9)。また，アミノ酸残基の組成に偏りを持たせたファージディスプレイライブラリー (ライブラリーサイズ: 約2×10^9) もあわせて作製した。
作製したファージライブラリーの選別を，モデル標的タンパク質であるGFPuvおよびyeast SUMOに対して行った。その結果，作製した2種類の単鎖モネリンを分子骨格とするファージディスプレイライブラリーからライブラリーから，GFPuvおよびyeast SUMOに結合する人工結合タンパク質をそれぞれ取得することができた。人工結合タンパク質を大腸菌で組換え発現させたところ，40 mLの培養スケールで数mgの精製サンプルを得ることができた。また，ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析により，人工結合タンパク質の溶液挙動がよいこと，親和性は低いと予想されるものの精製したモデル標的タンパク質に結合すること，を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画にしたがって，Chitinase A1のキチン結合ドメイン， 単鎖モネリンおよびKeap-1のKelch repeatドメインの3種類分子骨格として用いたファージディスプレイライブラリーの作製とライブラリーの選別に取り組んできた。本年度，単鎖モネリンを骨格とするファージディスプレイライブラリーが有用であることが明らかになり，研究が大きく進展した。
また，人工結合タンパク質の標的となるLDL受容体の細胞外領域について，新たに動物細胞を用いた組換えタンパク質発現系を構築した。別の標的であるcollagen Iについても，それを固定化したビーズの準備を終えている。
懸案であったファージディスプレイライブラリーの作製および標的タンパク質の調製の準備がおおむね完了したことから，表記の通りの進捗状況の区分とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度において作製した単鎖モネリンを分子骨格とするファージディスプレイライブラリーを用いて，LDL受容体およびcollagen Iに結合する人工結合タンパク質の取得にとりかかる。得られた人工結合タンパク質について，大腸菌において組換え発現して精製し，物性の評価，相互作用解析および結晶構造解析に取り組む。これと並行して，ファージディスプレイライブラリーの改良も実施する。
年度の後半においては，得られた人工結合タンパク質をLDL受容体やcollagen Iと共に培養細胞において強制発現させ，LDL受容体の細胞膜への移行やcollagen Iの細胞外への分泌の可否をそれぞれ検討する。これにより，人工結合タンパク質がLDL受容体やcollagen Iのプライベートシャペロン機能を模倣可能か否かを明らかにする。
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Research Products
(7 results)
