2017 Fiscal Year Annual Research Report
改造して理解するモータータンパク質F1-ATPaseの動作原理
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15H05592
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
古賀 信康 分子科学研究所, 協奏分子システム研究センター, 准教授 (50432571)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質分子デザイン / 分子モーター / F1-ATPase / 改造 / 構造変化 / 分子シミュレーション / 計算機デザイン / 生化学実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、計算機と生化学実験、両方の手段を用いて合理的にATPをエネルギー源として駆動する回転モータータンパク質F1-ATPaseを改造することにより、その動作原理を明らかにすることを目的とする。F1-ATPaseはαおよびβサブユニットが交互に３つずつ並んだ６量体のリング構造を形成し、リング中心を回転子であるγサブユニットが貫いている。３つのβサブユニットが協同しながら順番にATPと結合・加水分解を行うことにより、自身の構造を大きく変化させ、γサブユニットを回転させている。αおよびβサブユニットは配列および構造が良く似ており、どちらもP-loop (GxxxxGKT/S)と呼ばれるリン酸結合部位を持つ。しかしながら、βサブユニットはATPを加水分解してOpen-Closedの構造変化を示すのに対し、αサブユニットはATPを結合するのみでClosedのままである。βサブユニット構造中に、ATP加水分解とそれに伴う構造変化の仕組みはどのように組み込まれているのだろうか？αおよびβサブユニットの結晶構造を比較することにより、P-loopのxxxxに対応する残基の違いが構造変化に重要なのではないかと考え、当該年度も引き続き、βのP-loopにおいてそれらの残基をαのものに変異したときの構造変化能に及ぼす影響を、分子シミュレーション、１分子回転計測実験等を用いて調べた。特に、当該年度は、分子動力学シミュレーションで得られたトラジェクトリを個々の残基の二面角や残基間相互作用を用いて詳細に解析することにより、どの変異がどのような相互作用によってP-loop構造に影響を及ぼしているのかを残基単位で検証した。また、実験的には、変異の入りにくかった最後の変異体であるXの４番目の残基の変異体作成に成功し、１分子回転計測実験を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
βサブユニットの野生型とP-loopの残基をαのものに変異させた変異体、両方の分子動力学シミュレーションを行い、個々の残基の二面角や残基間相互作用を用いて詳細に解析・比較することにより、その変異が構造変化能に及ぼす影響を調べた。また、実験的にはαサブユニットは加水分解能を持たないため、αのP-loopの残基をβのものに変えても何も起こらないが、計算機上では、その変異によってP-loopの構造変化能がどのように変わるのか検証可能であることから、この野生型と変異体についても分子動力学シミュレーションを行い、詳細に解析を行った。また、実験的には、変異の入りにくかった最後の変異体であるXの４番目の残基の変異体を作成し、大腸菌でその変異タンパク質を発現・精製し、１分子回転計測実験を行い、その変異がβサブユニットの構造変化、ひいてはF1-ATPaseの回転に与える影響を調べた。全体としては研究はおおむね順調に進んでいるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、βサブユニットのP-loopの構造変化に重要であると思われる部位の変異が構造変化能に及ぼす影響を、分子動力学シミュレーション、生化学実験、１分子回転計測実験等を用いて詳細に検証する。特に、分子動力学シミュレーションで得られたトラジェクトリを詳細に比較・解析することにより、どの変異がどのような相互作用によって構造変化能に影響を及ぼしているのかを残基単位で検証する。また、実験からのアプローチとしては、ATP加水分解測定から構造変化と密接に関係していると思われるADP阻害へのかかりやすさを検証したり、FRET等を用いてβサブユニット単体の構造変化を検出する方法を開発することにより、βサブユニットが構造変化しているかどうかを検証する。そして、最終的には、X線結晶構造解析等を行うことにより更なる検証を行う。また、P-loop以外の場所で構造変化に重要であると思われる部位（以前に同定されたシーソーモチーフを含む）についても改造を行うことにより、それらの改造が構造変化能に及ぼす影響を検証する。このようにして、βサブユニット構造中に組み込まれている構造変化の仕組みを解明する。
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Research Products
(2 results)
