2018 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanisms of phospholipid scrambling on plasma membranes by Xkr8
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15H05651
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
鈴木 淳 京都大学, 高等研究院, 教授 (30511894)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ホスファチジルセリン / アポトーシス / サブユニット / CRISPR / スクリーニング / シャペロン / Xkr / スクランブラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までにXkr8のサブユニットとしてBSG/NPTNを同定し、Xkr8はそれらのどちらかに結合することで細胞膜に移行することから、BSG/NPTNはXkr8を細胞膜に移行させるためのシャペロンとして機能すると結論付けた。。一方で、同じファミリーメンバーのXkr4に関してはBSG/NPTNの両方を欠損させた細胞に発現させても細胞膜に移行することから別のシャペロンがあると考えられる。そこでXkr4発現細胞においてXkr4複合体を解析するとXkr4以外のタンパク質は含まれていないことが分かった。ゆえに、Xkr4を細胞膜に移行させるサブユニットがあるとすると、Xkr4を細胞膜に移行させた後、Xkr4から解離していると考えられた。これは、Xkr4を細胞膜に移行させるシャペロンを同定するためには、タンパク質間結合を指標とした生化学的なアプローチではなく、遺伝学的なアプローチが適していることを意味している。そこで、活性化型Xkr4にtagRFPを付加したものを細胞に発現させ、NBD-PCの取り込み活性をスクランブラーゼ活性の指標にした遺伝学的スクリーニングを行うことにした。すなわち、活性化型Xkr4-tagRFPを発現している細胞にCRSPR/Cas9 sgRNA libraryを発現させ、Xkr4の発現はあるものの（tagRFP positive）、NBD-PCの取り込み活性が無い細胞集団をFlow cytometryを用いてソーティングした。その結果、そのような細胞が濃縮されることが分かった。現在、この細胞よりゲノムDNAを調製し、組み込まれたsgRNAをPCRにより増幅し、次世代シークエンサーを用いて解析している。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(7 results)
