ミトコンドリア生合成を司る細胞内統合的ネットワークの解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H05705
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 遠藤 斗志也 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (70152014)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田村 康 山形大学, 理学部, 准教授 (50631876)
• Project Period (FY): 2015 – 2019
• Keywords: ミトコンドリア / TOM複合体 / Tom40 / タンパク質輸送 / 脂質輸送 / Upsタンパク質 / ERMES

Outline of Annual Research Achievements

本研究では, サイトゾルからミトコンドリアへのタンパク質の輸送, および膜間の脂質の輸送を中心に, ミトコンドリアが細胞内でいかに作られるかという根源的問題の分子機構を統合的に理解することをめざしている。
まずタンパク質の交通については, 1000種類以上のミトコンドリアタンパク質の入り口として機能する「タンパク質専用の外膜透過装置」TOM複合体について, 構成タンパク質がどのように集合して複合体をつくり, どのように前駆体タンパク質を効率よく膜透過させるかについて, 計算科学による構造予測と部位特異的光架橋法を組み合わせて解析を行った。複合体の中心因子Tom40がつくる円筒構造の内側は, 前駆体タンパク質が外膜を透過するための通り道として機能し, 異なるタイプの前駆体ごとに, 別々に最適化された通り道が用意されていた。Tom40のN末端領域は円筒構造内を貫通して膜間部側でシャペロンタンパク質を集め, 疎水性前駆体を効率良く受け渡していた。さらにTOM複合体にはTom40から成る孔が3つの完成型と, 孔が2つの準備型の2つの状態があり, それらを可逆的に変換することで新しいTom40を古いTom40と入れ替え, 完全な機能をもつ複合体を維持していることが示唆された。
脂質の交通については, ミトコンドリアの外膜から内膜に脂質を輸送するUpsタンパク質・(Ups1, Ups2)に関して, 構造解析(Ups1)とin vitroでの脂質輸送解析(Ups1, Ups2)を行うとともに, 酵母細胞から単離したミトコンドリア-ER膜画分を用いて, in vitroでERからミトコンドリアへのホスファチジルセリン(PS)輸送とミトコンドリアからERへのホスファチジルエタノールアミン(PE)輸送をモニターするアッセイ系を確立。この系を用いてミトコンドリア-ER間コンタクトを形成するERMESがPS輸送には関わるがPE輸送には関わらないことを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

タンパク質輸送については, TOM複合体のアセンブリー構造の解析が完了したので, これにもとづきラテラルリリースの機構解析を進めている。PINK1や0m45誘導体を含めた基質の検討, Tom40チャネルのラテラル開閉を点変異導入したCys間の架橋で阻害する条件検討を進め, 順調に成果があがっている。酵母細胞へPINK1-Parkinシステムを導入したシステムを使って, PINK1-Parkin発現による細胞の増殖阻害を強める, あるいは弱める低分子化合物のスクリーニングを行っている。スクリーニングは順調に進んでおり, 候補化合物が得られている。ノンストップ(NS)タンパク質のミトコンドリア膜, ER膜上での品質管理について, サイトゾルのユビキチンリガーゼLtn1の有無の影響の解析を行い, 順調に結果が出ている(一部投稿中)。
脂質輸送については, ER-ミトコンドリア間の脂質(PSとPE)の輸送をモニターできるin vitroアッセイ系の確立に成功し, 現在投稿中である。この系を用いて, ERMESがER-ミトコンドリア間のPS輸送に関わる事を直接証明することに成功した(投稿中)。またミトコンドリアの外膜と内膜の間でホスファチジン酸(PA)を輸送するUps1-Mdm35についてX線構造を決定し, 脂質輸送の分子機構を解明した。Ups2についても脂質輸送能をin vitroで証明し(九州大学久下理教授との共同研究), 順調に成果があがっている。

Strategy for Future Research Activity

まだ研究を開始して1年が経過していない段階であるが, 特に問題は生じていない。脂質解析用の質量分析計をはじめとする設備機器を導入し, 使用を開始している。研究代表者のグループでは研究員4名(エフォート管理による), 研究補助員2名, 研究分担者のグループでは研究員1名の雇用も開始し, 順調に研究が始まっている。
今後の研究計画は以下の通り。
・外膜トランスロケータのラテラルゲート開閉に関する変異体作成Tom40とTom22, Tom40とTom7の相互作用部位の点変異体を作製し, TOM40複合体のアセンブリー, 基質のラテラルリリースへの影響を調べ, Tom40チャネルのラテラルゲート開閉の機構を明らかにする。
・内膜トランスロケータから内膜へのラテラルな組込みについて, 開閉部位をCys間架橋で閉じることを試みる。
・酵母細胞へのPINK1・Parkinシステムの移植とその利用について, すでに得られつつある低分子化合物のスクリーニングを進める。
・NSタンパク質へのユビキチン付加による膜透過チャネル占有の阻害が起こるかどうかを検討する。
・ERMESによるER-ミトコンドリア間脂質輸送機構について, 特にサブユニット間相互作用部位の特定, そこへの変異導入を試みる。
・ミトコンドリアと他のオルガネラ間接合部位の探索を進める。
・ERMESクラスタリングの意義と調節について研究を進める。
・確立した脂質輸送のin vivo解析系を利用して, 脂質輸送に関わる因子の機能解析を進めるとともに, in vivoで膜間脂質の輸送をモニタリングする系の開発を行う。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Monash University(オーストラリア)
  • Country Name: AUSTRALIA
  • Counterpart Institution: Monash University
• [Int'l Joint Research] Universitaet Freiburg(ドイツ)
  • Country Name: GERMANY
  • Counterpart Institution: Universitaet Freiburg
• [Int'l Joint Research] Stockholm University(スウェーデン)
  • Country Name: SWEDEN
  • Counterpart Institution: Stockholm University
• [Journal Article] Structural and mechanistic insights into phospholipid transfer by Upsl-Mdm35 in mitochondria. (2015)
  • Author(s): Y. Watanabe, Y. Tamura, S. Kawano, and T. Endo
  • Journal Title: Nature Commun Volume: 6
  • DOI: 10.1038/ncomms8922
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular architecture of the active mitochondrial protein gate (2015)
  • Author(s): T. Shiota, K. Imai, J. Qiu, V. L. Hewitt, K. Tan, H. Shen, N. Sakiyama, Y. Fukasawa, S. Hayat, M. Kamiya, A. Elofsson, K. Tomii, P. Horton, N. Wiedemann, N. Pfanner, T Lithgow, T. Endo
  • Journal Title: Science Volume: 349 Pages: 1544-1548
  • DOI: 10.1126/science.aac6428
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Protein import into mitochondria and the ER (2016)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: Gordon Research Conference : Protein transport across cell membranes
  • Place of Presentation: Galveston, TX, USA
  • Year and Date: 2016-03-06 – 2016-03-11
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ミトコンドリア生合成のためのタンパク質と脂質の交通 (2015)
  • Author(s): 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)シンポジウム「オルガネラバイオロジー : 細胞の構造と機能の新しい姿」
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • Invited
• [Presentation] Mdm12とMmm1によるリン脂質輸送メカニズムの解明 (2015)
  • Author(s): 河野慎, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ERMES複合体の機能に関連する新規遺伝子の同定 (2015)
  • Author(s): 小島理恵子, 梶原秀, 遠藤斗志也, 田村康
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Ups1-Mdm35複合体の結晶構造から明らかになったミトコンドリア膜間のリン脂質輸送機構 (2015)
  • Author(s): 渡邊康紀, 田村康, 河野慎, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Tom22のミトコンドリア局在化におけるPor1の役割の解明 (2015)
  • Author(s): 石坂直也, 塩田拓也, 田村康, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 試験管内リン脂質輸送実験系を用いたミトコンドリア・小胞体間リン脂質輸送因子の検索 (2015)
  • Author(s): 古田詩唯奈, 遠藤斗志也, 田村康
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ミトコンドリアクリステジャンクション形成に関与するMic19の輸送機構の解析 (2015)
  • Author(s): 植田依里, 田村康, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 出芽酵母の主要な細胞質Hsp70であるSsa2pは, tRNAの核内輸送体として働く (2015)
  • Author(s): 高野晃, 梶田拓弥, 望月誠, 遠藤斗志也, 吉久徹
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 小胞体分子シャペロンによる植物有性生殖過程の核膜融合の制御 (2015)
  • Author(s): 西川周一, 丸山大輔, 山口友輝, 東山哲也, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)ワークショップ「受精を支える分子とそれを取り巻く分子環境」
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • Invited
• [Presentation] タンパク質膜挿入・膜透過に関与する糖脂質酵素MPIaseのin vivoにおける機能解析 (2015)
  • Author(s): 沢里克宏, Michael Moser, 佐藤諒, 田村康, 遠藤斗志也, 西山賢一
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 出芽酵母を用いたミトコンドリア-液胞間新規テザリング因子の遺伝学的探索 (2015)
  • Author(s): 両角勇紀, 久田萌子, 遠藤斗志也, 田村康
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ミトコンドリア低分子キャリアータンパク質Hem25の機能解析 (2015)
  • Author(s): 鈴木万葵, 小島理恵子, 遠藤斗志也, 田村康
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ミトコンドリア内膜膜透過装置構成因子Tim50の相互作用解析 (2015)
  • Author(s): 柚木-江崎芳, ラーマンバイチュル, 石丸雄基, 河野慎, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ミトコンドリア・小胞体間リン脂質輸送反応の再構成実験系の確立 (2015)
  • Author(s): 田村康, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Analysis of outer membrane insertion mechanism of yeast mitochondrial protein (2015)
  • Author(s): Jiyao Song, 田村 康, 吉久 徹, 遠藤斗志也
  • Organizer: BMB2015(第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル, 神戸国際会議場, 神戸国際展示場, 神戸商工会議所(兵庫県, 神戸市)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] How the cell makes mitochondria from proteins and lipids (2015)
  • Author(s): Toshiya Endo
  • Organizer: The Crash Seminar from Japan by the former JSPS program officers : Biological Science 2015 in Japan
  • Place of Presentation: Zurich, Switzerland
  • Year and Date: 2015-10-28
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] Endo Lab.
  • URL: http://endolab.jp/wp/