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15H05705
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
遠藤 斗志也 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (70152014)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 康 山形大学, 理学部, 准教授 (50631876)
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| Project Period (FY) |
2015 – 2019
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| Keywords | ミトコンドリア / TOM複合体 / Tom40 / タンパク質輸送 / 脂質輸送 / Upsタンパク質 / ERMES |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では, サイトゾルからミトコンドリアへのタンパク質の輸送, および膜間の脂質の輸送を中心に, ミトコンドリアが細胞内でいかに作られるかという根源的問題の分子機構を統合的に理解することをめざしている。
まずタンパク質の交通については, mRNAから終止コドンを欠くことで生じるノンストップタンパク質について, ER膜とミトコンドリア外膜における品質管理の解析をすすめ, その一部を論文発表した。特に膜タンパク質においては, ノンストップ膜タンパク質の膜トポロジーに応じて, オルガネラ内腔の可用性タンパク質と同様の品質管理を受けるケースとサイトゾルのタンパク質と同様の品質管理を受けるケースに分類できることが重要であり, これはERだけでなくミトコンドリアにも適用できる原理だと考えられる。in vivoで, ノンストップミトコンドリアタンパク質がミトコンドリアの外膜膜透過装置TOM複合体のTom40チャネルを塞ぎ, 増殖阻害を引き起こすことを見いだしているが, ノンストップタンパク質の膜貫通(TM)配列があるとラテラルリリースによりTom40チャネルから解離し, 増殖阻害が解除されることを見いだした。TM配列をTOM複合体が認識してラテラルリリースを促す分子機構について, in vitroでも解析を行い, ラテラルリリースの機構について投稿準備中である。
脂質の交通については, ミトコンドリアの外膜から内膜に脂質を輸送するUpsタンパク質(Ups1, Ups2)に関して, Ups2がミトコンドリア外膜と内膜の間でホスファチジルセリンを輸送することを見いだし, in vitroの実験系でUps2のPS輸送能を直接証明, 論文として発表した(九大の久下教授との共同研究)。また, 酵母細胞から単離したミトコンドリア-ER膜画分を用いて, in vitroでERからミトコンドリアへのホスファチジルセリン(PS)輸送とミトコンドリアからERへのホスファチジルエタノールアミン(PE)輸送をモニターするアッセイ系を確立。この系を用いてミトコンドリア-ER間コンタクトを形成するERMESがPS輸送には関わるがPE輸送には関わらないことを見出し, 論文発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質輸送については, TOM複合体におけるラテラルリリースの機構解析結果が, 投稿準備段階である。ノンストップミトコンドリアタンパク質を酵母細胞内で発現させ, リボソーム新生鎖(RNC)-TOM複合体として大量に精製する方法を確立し, RNC-TOM複合体のクライオEM構造解析を行った。リボソーム部分について分解能4Åレベルの構造が得られ, リボソームからTOM複合体に向かってRNAのES27が伸びていることが分かった。ES27がリボソームとTOM複合体の相互作用を担う可能性が考えられ, リボソームとTOM複合体の相互作用解明の突破口となることが考えられる。ミトコンドリアの品質管理に関わるヒトのPINK1-Parkin系を出芽酵母細胞内で発現すると増殖阻害が引き起こされるが, この増殖阻害を欠損により抑制する遺伝子の選別を, 酵母遺伝子破壊ライブラリーを用いて行い, プロテアソームアセンブリーシャペロン遺伝子(POC1, 2, 3)を同定した。哺乳動物と酵母細胞での不良ミトコンドリアの検出除去システムの相違とプロテアソームの関与という重要な知見と考えられる。
脂質輸送についてはsplitGFPを用いて, ミトコンドリアと他のオルガネラ間のコンタクト部位を検出する実験系の構築に成功した。ERMESクラスタリングが, ミトコンドリアの融合と分裂によって制御されることを発見し, 投稿準備中である。28年度に確立した脂質輸送のin vitro解析系を利用して, 脂質合成輸送に関わる因子としてPah1(ホスファチジン酸脱リン酸化酵素)を同定, Pah1が欠損した細胞ではリン脂質合成酵素量が顕著に減少することを明らかにした。ミトコンドリア融合因子Mgm1とミトコンドリア膜間部に存在するリン脂質輸送因子が欠損した細胞では, カルジオリピン合成ができなくなり, ミトコンドリア内膜のクリステ構造が消失することを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究を開始して2年近くが経過したが, 特に問題は生じていない。脂質解析用の質量分析計をはじめとする設備機器を導入し, 使用を開始している。研究代表者のグループでは研究員5名(エフォート管理による), 研究補助員2名, 研究分担者のグループでは研究員1名を雇用し, 順調に研究が進んでいる。うち1名はアカデミアでのポジション取得が決まった。
今後の研究計画は以下の通り。
・外膜トランスロケータとリボソームの相互作用をES27が担う可能性の検討。ES27の相互作用に関わると考えられる部分をin vitroで転写し, 精製したTOM複合体および単離ミトコンドリアとの相互作用をin vitroで解析する。相互作用に関わるTOM複合体側のサブユニットをRNAとのUV照射による光架橋で検出する。
・外膜のβバレル型膜タンパク質のアセンブリーに関わるSAM複合体, および内膜トランスロケータ(TIM23複合体, TIm22複合体)について構造解析を進める。内膜へのラテラルな組込みについては, Tim23およびTim22の各チャネルのラテラル開閉部位をCys間架橋で閉じることを試みる。
・酵母細胞へのPINK1・Parkinシステムの移植については, プロテアソームがミトコンドリア上に集められていることの証明, そのことがなぜ増殖阻害につながるのかを解明する。
・出芽酵母を用いてオルガネラ間splitGFP発現細胞と遺伝子欠損ライブラリーをかけ合わせる, もしくはゲノムライブラリーを導入し, オルガネラコンタクト(split GFPのシグナル)が増減する遺伝子を単離することで新規オルガネラ間コンタクト因子を同定する。同様のシステムとアプローチを哺乳動物培養細胞に展開する準備を進める。
・ER-ミトコンドリアコンタクト部位を形成するERMES複合体クラスターについては, その動的性質, 融合や分裂が能動的に起こるかどうかなど不明である。ミトコンドリアの融合にともないERMESどうしが融合するかを, ライブセルイメージングにより検討する。
・PA合成に関わるPah1欠損細胞において, リン脂質合成酵素量が減少するメカニズムを解明する。具体的にはリン脂質合成酵素群をコードする遺伝子の転写因子の局在の変化を検討する。
・ミトコンドリア融合因子Mgm1とミトコンドリア膜間部に存在するリン脂質輸送因子が欠損した細胞でカルジオリピンが減少するという, 新たな知見について, その原因の検討を進める。具体的にはこの細胞におけるカルジオリピン合成酵素の量の変化から検討を行う。
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