2016 Fiscal Year Annual Research Report
CRISPRによるRNA病モデルｉＰＳ細胞・動物の構築と病態解明・治療薬創製
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15H05721
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
萩原 正敏 京都大学, 医学研究科, 教授 (10208423)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細谷 孝充 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 教授 (60273124)
鶴山 竜昭 京都大学, 医学研究科, 特定教授 (00303842)
武内 章英 京都大学, 医学研究科, 准教授 (90436618)
大江 賢治 京都大学, 健康長寿社会の総合医療開発ユニット, 特定講師 (30419527)
飯田 慶 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00387961)
奥野 友紀子 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00372524)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝性疾患 / スプライシング制御 / ポストゲノム創薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題ではスプライシング異常に起因する「RNA病」に対して、低分子化合物によるRNAスプライシング制御への介入による治療薬の創製、さらには、CRISPR/Cas9技術等で作製したモデルiPS細胞・モデル動物を使った介入様式の解明や有効性の実証を目指している。我々の研究グループでは疾患原因変異を含むエクソンのスキッピングを誘導することで、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療につながりうる低分子化合物：TG003を開発しているが、研究目標を達成するためには、この化合物の標的エクソンやその作用機序を明らかにすることが必要である。このため、分化させたヒト骨格筋由来細胞を対象として、TG003処理(20μM, 4時間)を行ったmRNA-seqデータを取得・解析したところ253個のエクソンにおいてスキッピングが誘導されていることがわかった。これに対し未分化のヒト骨格筋由来細胞でも同様の解析を行ったところスキッピング誘導が生じたエクソンは148個で、分化ヒト骨格筋細胞での結果との一致はわずか14個であった。スプライシング操作化合物の標的エクソンは組織により大きく変化することがわかった。このため研究目的に応じて、より厳密に解析環境を選別する必要があることがわかった。筋肉組織の解析対象として、ヒト骨格筋由来の細胞より安定した実験材料である不死化筋肉細胞を、また2015年に家族性自律神経失調症（FD）の治療薬候補として報告した新規スプライシング操作化合物であるRECTASについて、ヒト乳腺癌由来細胞MCF-7を用いてmRNA-seq解析を行った。この結果30個のスキッピング誘導エクソンと11個の含有誘導エクソンを見出した。RECTASについてはより患者に近い環境での解析を進めるため、FD患者の繊維芽細胞を対象にmRNA-seqデータを取得する準備も進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
スプライシング操作化合物の組織ごとの作用の違いが想定以上に大きかった判明したため、平成28年3月の段階で3か月間の研究計画の延長を行った。延長期間に計画していた解析である、スプライシング操作化合物TG003がスキッピング効果を持つと予測された変異に対して、変異を含むエクソンおよびその前後の塩基配列をプラスミドに組み込み、RT-PCRでTG003の効果の有無を判定するレポーターアッセイ系を立ち上げることができた。また、ジストロフィノパチーを引き起こす遺伝子変異である[DMD_c.4303G>T]を解析する対象として不死化筋肉細胞を選別し、分化条件の検討やジストロフィンタンパク質の発現状況の解析を進めた。さらに、筋細胞分化のマスター転写因子である MyoDを発現するMyoD-hiPS 細胞を対象にCRISPR/CAS9技術を用いた遺伝子変異導入法の検討・準備を進めることもできた。これらを含め、平成28年度に予定していた研究計画は延長期間を含めた期間内にすべて達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究期間中に立ち上げを行った、遺伝子変異型スプライシングレポーターを用いたアッセイ系を用いてTG003処理を行った際のスキッピング誘導の有無の解析を進める。当初の解析対象として、これまでに取得したmRNA-seqをもとに構築したTG003の標的エクソン予測アルゴリズムによる予測結果を用いる。すなわち、TG003がスキッピング誘導を起こすと予測された疾患原因変異を持つエクソンを10種程度選別し解析を行う予定である。また、TG003はスプライシング因子であるSRタンパク質のリン酸化を行うCLKファミリータンパク質の阻害を通じてスプライシング変化を引き起こすことがわかっている。この知見や、これまで得られたTG003標的エクソンの特徴に基づき、TG003は偽エクソン（本来はイントロンである領域内に生じるエクソン）に起因する遺伝性疾患の治療に効果を持つことが予想される。これらの疾患を対処に、TG003で治療可能な遺伝性疾患候補の探索をさらに進める予定である。また、スプライシング操作化合物の効果の評価を行うためモデル細胞系の構築を目的として、MyoD-hiPS 細胞を対象にしたCRISPR/CAS9技術による疾患原因変異の導入をさらに推進する。
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