2017 Fiscal Year Annual Research Report
CRISPRによるRNA病モデルｉＰＳ細胞・動物の構築と病態解明・治療薬創製
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15H05721
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
萩原 正敏 京都大学, 医学研究科, 教授 (10208423)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鶴山 竜昭 京都大学, 医学研究科, 特定教授 (00303842)
奥野 友紀子 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00372524)
飯田 慶 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00387961)
大江 賢治 福岡大学, 薬学部, 准教授 (30419527)
細谷 孝充 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 教授 (60273124)
武内 章英 京都大学, 医学研究科, 准教授 (90436618)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝性疾患 / スプライシング制御 / ポストゲノム創薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スプライシング操作化合物TG003処理(20μM, 4時間)mRNA-seqデータ解析の結果、ヒト骨格筋細胞で253個のエクソンにおいてスキップ誘導が生じていることがわかった。これらのエクソンとその周辺を対象にスプライシング制御配列の強さやスプライシング因子の結合配列の数など合計526個の要素について定量化を行った。これに基づきエクソン周辺の塩基配列を入力情報として、そのエクソンのTG003応答性を予測できるコンピュータプログラム（スプライシング操作化合物の介入ルール）の作製を行った。NCBI ClinVarデータベースに登録されている遺伝子疾患関連変異を解析した結果、119個の遺伝性疾患変異をTG003による治療効果が期待できる疾患としてリストアップした。遺伝子変異ベクターを導入したHeLa細胞を用いて検証実験を行った結果、7例中、4例においてTG003によるスキップ誘導が確認された
TG003が特定のCLK阻害を介してSRタンパク質の機能抑制に働くことから、当化合物はSR依存的にイントロン領域がエクソンとして認識される偽エクソンが原因となる疾患に対して特に有効な治療戦略になることが推測された。対象疾患の検索の結果、複数の偽エクソン疾患が該当し、嚢胞性線維症の原因となるCFTR遺伝子IVS22+12191変異、cblE型ホモシスチン尿症の原因となるMTRR遺伝子IVS6+469T>C変異それぞれに対してスプライシング変動によりGFP/RFPの発現が切り替わるdual reporterシステム（SPREADD）を作製し、化合物応答の検討を行った。結果、いずれにおいても疾患の原因となる偽エクソンの認識がTG003により抑制され、正常なスプライシングが回復することが明らかとなった。
その他、スプライシング制御化合物の合成展開やモデル細胞・モデル生物を用いた解析でも成果を得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1) 平成29年度から平成31年度にかけて行う予定であった、スプライシング操作化合物TG003の作用メカニズムの解明が予定以上に進捗し、SRタンパク質依存的に認識される偽エクソンのスキッピングに有効であることを見出した。嚢胞性線維症CFTR偽エクソン、cblE型ホモシスチン尿症MTRR偽エクソン等、複数の疾患に対する偽エクソン生成の抑制作用ならびに作用メカニズムの知見が得られた。さらに、化合物合成展開の検討から10倍以上の高活性化合物の取得に成功した。さらにiPS細胞を用いた解析も大きく進捗している。
2) 家族性自律神経失調症およびファブリー病について、スプライシング操作化合物RECTASにより治療効果が期待できることを明らかにした。これらについては当初の予定を大きく超え、すでに治験準備を進めており、近日中の治験開始を視野にいれつつある。
3) 同一条件で処理した細胞より高品質のRNAを回収する方法を確立し、RNA-Seqにより得られた情報を用いて、MISO (Mixture-of Isoforms)などによりトランスクリプトームの変化を検討し、スコア化した。これにより、当初想定した化合物の選択的スプライシングに対するルール化を行ったばかりでなく、広範な化合物のトランスクリプトームに対する影響を測定した独自の定量的データベースを構築出来た。この独自データベースを用いて、作用機序が未知だが有用な薬効を有する化合物の作用点を推定出来る事が判明した。
4) スプライシング操作化合物TG003に対する標的エクソン予測プログラムの試作を行い、119個の遺伝性疾患をTG003による治療効果が期待できる疾患としてリストアップした。遺伝子変異ベクターを導入したHeLa細胞を用いて検証実験を行った結果、実験を行った7例中、4例においてTG003による変異型エクソンのスキッピング誘導が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
スプライシング操作化合物TG003については、変異部位を含むエクソンのスキッピングが予測された遺伝性疾患7変異のうち4変異においてレポーター解析でスキッピング誘導を確認できている。これらの知見、および種々の遺伝性疾患におけるメカニズム解析を通じて、TG003は嚢胞性線維症を始めとする種々の疾患原因となる偽エクソンのスキッピングにおいて特に高い効果が期待できることが見出された。これらの系において情報の集約や更なる標的疾患の探索を進める。
2015年の研究で見出されたスプライシング操作化合物RECTASについてはmRNA-seqデータに基づく「スプライシング介入ルール」解明のための解析を進める。スプライシング介入ルールの解析には組織差や、個人差が影響することが明らかになってきているため、RECTASが治療効果を持ちうる家族性自律神経失調症を対象に、患者由来の培養細胞を用いて解析を行っておりこれを継続する。mRNA-seqデータの取得・標的エクソン予測プログラムの試作を通じて、作用メカニズムの推定および、適応疾患の拡大につながる研究を進める。
また、スプライシング療法の適応可能な標的RNA病を、より病態に近い形で評価するため、モデルiPS細胞を用いた解析を進める。モデルiPS細胞は正常細胞にCRISPR/Cas9法により遺伝子変異を導入する方法のほかに、患者由来の細胞から樹立したiPS細胞の使用を進めていく。
さらにRNA病モデルマウスを用いた解析準備をさらに進める。スプライシング操作化合物RECTASにおいて、家族性自律神経失調症の原因となるIKBKAP遺伝子の変異によるスプライシング異常、およびその異常をスプライシング操作化合物が是正できるかを評価するモデルマウスの準備を進め、個体レベルでのスプライシング操作の状況を明らかにすることを目指す。
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Research Products
(11 results)
