進化工学を利用した蛍光プローブの開発研究

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H05723
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 中井 淳一 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (80237198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安藤 恵子 埼玉大学, 理工学研究科, 特任教授 (40221741) ; 根本 直人 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727) ; 大倉 正道 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (70369172)
• Project Period (FY): 2015-05-29 – 2020-03-31
• Keywords: 進化工学 / 脳機能プローブ / 蛍光 / アプタマー

Outline of Annual Research Achievements

蛍光タンパク質およびそれを応用した可視化技術は生物、医学分野で非常に重要な技術となっている。我々はGFPをもとに蛍光Ca2+プローブG-CaMPを開発してきた。また最近では赤色蛍光カルシウムプローブ（R-CaMP）も開発している。これらのプローブは線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、等多くのモデル生物で利用され、神経細胞の活動のモニターや、再生医療の基礎研究でも分化した細胞の活動のモニターに応用されている。一方、ペプチドアプタマーは特定の分子と特異的に結合するペプチドで、通常ランダム配列の巨大なライブラリー中から選び出してくる。アプタマーは近年、分子認識が可能な生体物質として、生物工学的応用、薬剤への応用が検討されている分子である。本研究ではG-CaMPの蛍光リポーター部分を用い、分子認識部分にペプチドアプタマーを結合させ、種々の分子を認識できる蛍光プローブを迅速に作成する技術を開発する。
可視化技術は生物学、医学、薬学においてますます必要とされている重要な技術である。本研究は蛍光プローブの革新的開発手法に関するものであり、新たに開発する方法論では、蛍光プローブの作成でペプチドアプタマーを用いることにより、これまでよりより短時間に高性能な蛍光プローブが開発できるようになる。また、本研究で開発が見込める高性能な蛍光プローブを生物学、基礎医学、疾患の原因解明、創薬、疾患バイオマーカー等の検査薬、医薬品に利用することにより人類社会に貢献できると期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

（１）機能的アプタマーを用いた蛍光プローブ開発：機能的アプタマーとして既知のペプチドアプタマーを用い、それをGーCaMPのレポーター部分と分子生物学的に融合させたペプチドアプタマー蛍光プローブを作成した。このプローブを大腸菌に発現させ結合活性、蛍光に及ぼす影響について、機能解析した。
（２）高速スクリーニング法の確立：プローブ作成においてこれまで収率が低かった律速部分について新たなアイデアにより高速化を試みた。その結果、反応時間をこれまでより大幅に短縮させることが可能になったとともに、安定してプローブを作ることが可能になった。また、リポソームのスクリーニング法についてリポソームの作成条件を検討した。
セルソーターの導入により、スクリーニングを高速化することが可能になった。また、マイクロカロリーメーターの導入により、固定化していないサンプルの結合状態を例え蛍光を発しない状態でも検討することが可能になった。

Strategy for Future Research Activity

（１）ランダム配列を持つアプタマーを用いた蛍光プローブ開発：ランダム配列を用い蛍光プローブのプロトタイプを作成する方法を確立する。ランダム配列をG-CaMPのリポーター部分と結合させたライブラリーを作成し高速スクリーニング法でスクリーニングして、基質に結合して蛍光が変化する蛍光プローブを取得する。
（２）高速スクリーニング法の確立：スクリーニングの各部においてより効率的なスクリーニング法の検討を行う。また、リポソームの高速スクリーニング法を研究する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Zurich(スイス)
  • Country Name: SWITZERLAND
  • Counterpart Institution: University of Zurich
• [Journal Article] Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. (2016)
  • Author(s): Monai H, Ohkura M, Tanaka M, Oe Y, Konno A, Hirai H, Mikoshiba K, Itohara S, Nakai J, Iwai Y, Hirase H
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1038/ncomms11100
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] JSAP1/JIP3 and JLP regulate kinesin-1-dependent axonal transport to prevent neuronal degeneration. (2015)
  • Author(s): Sato T, Ishikawa M, Mochizuki M, Ohta M, Ohkura M, Nakai J, Takamatsu N, Yoshioka K
  • Journal Title: Cell Death and Differentiation Volume: 22 Pages: 1260-1274
  • DOI: 10.1038/cdd.2014.207
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A top-down cortical circuit for accurate sensory perception. (2015)
  • Author(s): Manita S, Suzuki T, Homma C, Matsumoto T, Odagawa M, Yamada K, Ota K, Matsubara C, Inutsuka A, Sato M, Ohkura M, Yamanaka A, Yanagawa Y, Nakai J, Hayashi Y, Larkum ME, Murayama M
  • Journal Title: Neuron Volume: 86 Pages: 1304-1316
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2015.05.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation and imaging of transgenic mice that express G-CaMP7 under a tetracycline response element. (2015)
  • Author(s): Sato M, Kawano M, Ohkura M, Gengyo-Ando K, Nakai J, Hayashi Y
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10(5):e0125354 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0125354
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparison of genetically encoded calcium indicators for monitoring action potentials in mammalian brain by two-photon excitation fluorescence microscopy. (2015)
  • Author(s): Podor B, Hu Y, Ohkura M, Nakai J, Croll R, Fine A
  • Journal Title: Neurophotonics Volume: 2(2):021014 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1117/1.NPh.2.2.021014
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 意識下活動動物からの特定神経活動記録法の開発. (2016)
  • Author(s): 山下哲, 犬束歩, Srikanta Chowdhury, 中井淳一, 大倉正道, 田口徹, 桑木共之, 山中章弘
  • Organizer: 第93回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-03-22 – 2016-03-24
• [Presentation] 光刺激・計測によるマウス大脳皮質層間信号統合のin vivo解析. (2016)
  • Author(s): 小泉協, 佐藤正晃, 大倉正道, 中井淳一, 林康紀, 八尾寛
  • Organizer: 第93回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-03-22 – 2016-03-24
• [Presentation] ２光子イメージング法での神経発火活動の検出に適した蛍光カルシウムプローブ蛋白質の比較検討. (2016)
  • Author(s): 大倉正道, Borbala Podor, Yi-ling Hu, Roger Croll, Alan Fine, 中井淳一
  • Organizer: 第89回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-03-09 – 2016-03-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生体内光刺激・計測によるマウス大脳皮質層間信号統合の可視化. (2015)
  • Author(s): 小泉協, 佐藤正晃, 中井淳一, 大倉正道, 林康紀, 八尾寛
  • Organizer: 生理研研究会「シナプス・神経ネットワークの機能ダイナミクス」
  • Place of Presentation: 生理学研究所（愛知県岡崎市）
  • Year and Date: 2015-12-02 – 2015-12-03
• [Presentation] G-CaMP7発現マウス大脳皮質脳細胞活動の細胞-領野スケール長期イメージング実験解析法. (2015)
  • Author(s): 茂木優貴, 安藤恵子, 沖篤志, 岩井陽一, 毛内拡, 平瀬肇, 大倉正道, 中井淳一
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Rational design of ultrafast, high-affinity calcium indicators for monitoring neuronal activity. (2015)
  • Author(s): Masatoshi Inoue, Atsuya Takeuchi, Shin-ichiro Horigane, Hajime Fujii, Satoshi Kamijo, Sayaka Takemoto-Kimura, Masamichi Ohkura, Keiko Gengyo-Ando, Masanobu Kano, Junichi Nakai, Kazuo Kitamura, and Haruhiko Bito
  • Organizer: Neuroscience 2014
  • Place of Presentation: McCormick Place（米国、シカゴ市）
  • Year and Date: 2015-10-17 – 2015-10-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 生細胞イメージングに向けた抗CD3抗体結合CdSe/ZnS 量子ドットのエンドサイトーシスの検討. (2015)
  • Author(s): 宇高光, 福田武司, 鈴木美穂, 大倉正道, 中井淳一, 鎌田憲彦
  • Organizer: 第24回日本バイオイメージング学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京理科大学葛飾キャンパス（東京都葛飾区）
  • Year and Date: 2015-09-25 – 2015-09-28
• [Presentation] Rational design of a novel high-affinity, ultrafast, red calcium indicator R-CaMP2. (2015)
  • Author(s): Masatoshi Inoue, Atsuya Takeuchi, Shin-ichiro Horigane, Hajime Fujii, Satoshi Kamijo, Sayaka Takemoto-Kimura, Masamichi Ohkura, Keiko Gengyo-Ando, Masanobu Kano, Junichi Nakai, Kazuo Kitamura, Haruhiko Bito
  • Organizer: 第58回日本神経化学大会
  • Place of Presentation: 大宮ソニックシティ（埼玉県さいたま市）
  • Year and Date: 2015-09-11 – 2015-09-13
• [Presentation] Cortical top-down inputs for precise sensory perception in mice. (2015)
  • Author(s): Manita S, Suzuki T, Homma C, Matsumoto T, Odagawa M, Yamada K, Ota K, Matsubara C, Inutsuka A, Sato M, Ohkura M, Yamanaka A, Yanagawa Y, Nakai J, Hayashi Y, Larkum ME, Murayama M
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Roles of zebrafish cerebellar neural circuitry in classical fear conditioning. (2015)
  • Author(s): Matsuoka K, Yoshida M, Asakawa K, Ohkura M, Nakai J, Kawakami K, Hibi M, Shimizu T
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Rational design of a novel high-affinity, ultrafast, red calcium indicator R-CaMP2. (2015)
  • Author(s): Inoue M, Takeuchi A, Horigane S, Ohkura M, Gengyo-Ando K, Fujii H, Kamijo S, Takemoto-Kimura S, Kano M, Nakai J, Kitamura K, Bito H
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Selective representation of a valued place in hippocampal CA1. (2015)
  • Author(s): Mizuta K, Sato M, Sekine Y, Kawano M, Tanvir I, Masumoto T, Ohkura M, Nakai J, Hayashi Y
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Real-time visualization of neuronal activity in zebrafish and C. elegans. (2015)
  • Author(s): Nakai J, Ohkura M, Kagawa-Nagamura Y, Muto A, Inoue M, Bito H, Kawakami K, Gengyo-Ando K
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] G-CaMP7を大脳皮質に発現するマウスを用いた神経活動のミクロマクロ解析法. (2015)
  • Author(s): 茂木優貴, 安藤恵子, 沖篤志, 岩井陽一, 毛内拡, 平瀬肇, 大倉正道, 中井淳一
  • Organizer: 第132回日本薬理学会関東部会
  • Place of Presentation: 明海大学浦安キャンパス（千葉県浦安市）
  • Year and Date: 2015-07-04 – 2015-07-04
• [Book] Optogenetic manipulation and probing. 『Optogenetics: light-sensing proteins and their applications』Part 2, Chapter 9 (2015)
  • Author(s): Ohkura M, Sadakari J, Nakai J
  • Total Pages: 409（133-148）
  • Publisher: Springer
• [Patent(Industrial Property Rights)] 可変焦点レンズ (2015)
  • Inventor(s): 中井淳一, 今井欽之
  • Industrial Property Rights Holder: 中井淳一, 今井欽之
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2015-137266
  • Filing Date: 2015-07-08