2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Fluorescent Probes with Molecular Evolution Engineering
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15H05723
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
中井 淳一 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (80237198)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 直人 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60509727)
大倉 正道 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (70369172)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2020-03-31
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| Keywords | 脳機能プローブ / 蛍光 / 分子進化 / 分子認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
機能的アプタマーを用いた蛍光プローブ開発：カルシウムイオンに感応し蛍光を発するG-CaMPのメカニズムを模倣し、標的分子に結合することにより蛍光を発する蛍光センサー分子を創製することを目的に以下のような分子デザインを行った。標的分子をすでに２種類のペプチドアプタマーが得られているIL-6Rとし、これに結合するCys2とCys4という２種類の結合サイトが異なるペプチドアプタマーをEGFPのN末端、C末端の両端にランダム領域を挟んで連結した構造をもつライブラリを構築し、cDNA displayライブラリの評価を行ったところ、目的の分子が合成されていることが分かった。
ランダム配列を持つアプタマーを用いた蛍光プローブ開発：カルシウムセンサーG-CaMPの蛍光素子部分のN末端およびC末端にランダム配列のペプチドアプタマーを連結したライブラリーを構築した。反応条件を最適化し、理論上10の12乗-10の13乗の多様性を持つDNAライブラリを構築した。mRNA display分子を合成した。
高速スクリーニング法の確立：セルソーターを用いた高速スクリーニング法を検討し、実験者の技量による影響を少なくした。
本研究は従来のペプチドアプタマーライブラリーより分子量において、各段に大きな分子量のライブラリーを構築するものであり、この目的のためにはライブラリー構築における各ステップで効率を落とさないように反応系を最適化する必要がある。本年度はライブラリー構築の条件を検討し最適化した。この成果はこれまで非常に困難であった分子量の大きなライブラリーの構築に大きく寄与するものと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
IL-6Rに結合するCys2とCys4という２種類の結合サイトが異なるペプチドアプタマーをEGFPのN末端、C末端の両端にランダム領域を挟んで連結した構造をもつライブラリを構築した。Cys-3,-4はいずれもアミノ酸残基で２５残基程度であるため、併せても５０残基程度である。また、ランダム部分は３０残基程度である。そのため、GFPは２３８残基であることを考慮すると、ほぼ３００残基程度のタンパク質ライブラリとなる。しかし、３００残基のタンパク質を提示したcDNA display分子は発現効率が低いことが判明し、効率化をさらに高めるための最適化を行う必要が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
機能的アプタマーを用いた蛍光プローブ開発：ライブラリー構築の更なる効率化に取り組む。
ランダム配列を持つアプタマーを用いた蛍光プローブ開発：ライブラリー構築の更なる効率化に取り組む。
高速スクリーニング法の確立：酵母ディスプレイ法やファージディスプレイ法は発現タンパク質の評価がしやすい系である。cDNAディスプレイ法に酵母ディスプレイ法を組み合わせてスループットよくスクリーニングできる方法を検討する。
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Research Products
(34 results)
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[Presentation] Ultra-thin fluorescence endoscope imaging system for functional biological imaging2017
Author(s)
Osanai M, Ohkawa N, Kamiya A, Inami C, Sato M, Ohkura M, Kojima T, Kohmura Y, Hayashi Y, Yanagawa Y, Ohsawa M, Nakai J, Inokuchi K, Homma N, Mushiake H
Organizer
計測自動制御学会 システム・情報部門 学術講演会 2017
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[Presentation] Unraveling the dynamism of engram cells during contextual memory processing2017
Author(s)
Ghandour K, Ohkawa N, Fung CCA, Saitoh Y, Takekawa T, Asai H, Okubo-Suzuki R, Nomoto M, Soya S, Tsujimura S, Nishizono H, Matsuo M, Sato M, Ohkura M, Nakai J, Hayashi Y, Sakurai T, Osanai M, Fukai T, Inokuchi K
Organizer
Society for Neuroscience 2017 Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Functional breakdown processes of neural circuits in hippocampal CA1 region of Alzheimer’s disease model mice2017
Author(s)
Takamura R, Mizuta K, Sekine Y, Islam T, Saito T, Takekawa T, Ohkura M, Fukai T, Nakai J, Saido TC, Hayashi Y
Organizer
Society for Neuroscience 2017 Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Cellular mechanisms for the formation and plasticity of hippocampal cognitive maps2017
Author(s)
Sato M, Mizuta K, Islam T, Kawano M, Takekawa T, Gomez-Dominguez D, Yamakawa H, Ohkura M, Fukai T, Nakai J, Hayashi Y
Organizer
Society for Neuroscience 2017 Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] 頭部固定コモンマーモセット一次運動野における前肢運動課題実行中の2光子イメージング2017
Author(s)
蝦名鉄平, 正水芳人, 平川玲子, 渡我部昭哉, 大倉正道, 小林憲太, 纐纈大輔, 南部篤, 彦坂和雄, 佐々木えりか, 中井淳一, 山森哲雄, 松崎政紀
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] 海馬CA1セルアセンブリによる報酬事象表現2017
Author(s)
水田恒太郎, 佐藤正晃, 関根友紀子, 河野真子, イスラム タンビル, 高村理沙, 竹川嵩志, 大倉正道, 深井朋樹, 中井淳一, 林康紀
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] 脳機能イメージングのための極微細蛍光内視鏡イメージングシステム2017
Author(s)
小山内実, 大川宜昭, 坂本一寛, 三輪秀樹, 菊田里美, 田村篤史, 佐藤正晃, 大倉正道, 小島太郎, 幸村裕治, 中井淳一, 林康紀, 柳川右千夫, 井ノ口馨, 本間経康, 虫明元
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] Identification of characteristic dynamism of engram cells during learning2017
Author(s)
Ghandour K, Ohkawa N, Fung CCA, Saitoh Y, Takekawa T, Asai H, Okubo-Suzuki R, Nomoto M, Tsujimura S, Nishizono H, Matsuo M, Sato M, Ohkura M, Nakai J, Hayashi Y, Fukai T, Inokuchi K
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] 海馬認知地図形成の神経細胞ダイナミクス2017
Author(s)
佐藤正晃, 水田恒太郎, Islam T, 河野真子, 竹川高志, Gomez-Dominguez D, 山川宏, 大倉正道, 深井朋樹, 中井淳一, 林康紀
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] アルツハイマー病モデルマウス海馬CA1領域における神経機能回路の破綻過程2017
Author(s)
高村理沙, 水田恒太郎, 関根友紀子, Islam T, 斉藤貴志, 竹川高志, 大倉正道, 深井朋樹, 中井淳一, 西道隆臣, 林康紀
Organizer
第40回日本神経科学大会
Int'l Joint Research
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[Presentation] Olfactory receptor for prostaglandin F2alpha mediates courtship behavior of male zebrafish2017
Author(s)
Yabuki Y, Koide T, Miyasaka N, Wakisaka1, Masuda M, Ohkura M, Nakai J, Tsuge K, Tsuchiya S, Sugimoto Y, Yoshihara Y
Organizer
第17回嗅覚味覚国際シンポジウム
Int'l Joint Research
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