2016 Fiscal Year Annual Research Report
Regulatory mechanism of immunoglobulin diversification and genome instability through RNA-editing by AID
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15H05784
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
本庶 佑 京都大学, 医学研究科, 客員教授 (80090504)
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| Project Period (FY) |
2015-05-29 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA切断 / 組換え / 獲得免疫 / 免疫記憶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CH12細胞でTop1 3'UTRノックアウト細胞を作成した。（未発表）。現在Ago2の免疫沈降とRNA ligaseを用いる方法でTop1 mRNAに結合するmiRNAの同定を進めている。AID-flagを発現させる293T細胞を作成しhnRNP K遺伝子のC末端にHAタグを挿入することに成功した。同細胞を用いてAIDとhnRNP Kとの複合体に結合するRNAを解析しAIDにより編集されたRNAの同定を進めている。AIDの構造解析についてはAIDとRNA結合タンパク質の結晶生成を試みている。 Top1 結合タンパク質の同定と機能解析についてはTop1-GFP 融合タンパク質を用いたGFPトラップ法によりTop1 会合タンパク質をプロテオミクスにて解析し、Smarca4もTop1のクロマチン上への集積を促進する因子であることを発見し、論文を発表した。APE1もTop1と会合する因子として同定されたが抗体遺伝子のAIDによるDNA切断にAPE1は関与しないことを証明した。（論文投稿中）。CH12 細胞の抗体遺伝子S 領域にLexA 結合サイトを導入し、さらにLexAタンパク質を発現させた細胞を作成した。安定同位体標識アミノ酸を用いるSILAC法で結合タンパク質を同定する実験を進めた。hnRNP L遺伝子のC末端にHAタグが挿入された293T細胞を樹立しcofactor hnRNP L とAIDの連続免疫沈降実験の条件を整え、最終的にRNA産物を回収した。CSRのDNA修復過程に関わるヒストン関連因子を同定し、同分子と各種スプライシング因子との関連、DNA修復における機能を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）AIDによるTop1 mRNAの翻訳制御機能の解明：a) Top1 3'UTRノックアウトCH12細胞株からTop1 mRNA上のmiRNAの結合部位がcoding領域であることを明らかにした。RNA ligaseを用いるAgo2の免疫沈降法によりTop1 mRNAに結合するmiRNAとTop1上のmiRNA結合部位を解析している。b) hnRNP K遺伝子C末端にHAタグを挿入した293T細胞を樹立しAIDとhnRNP Kとの複合体に結合するRNA解析を進め、AIDにより編集されるRNAを同定中である。c) AIDの構造解析について28年度中に共役因子を含め解析した。
２）Top1 によるDNA 切断ターゲットの特異性決定機構の解明: a) Top1のDNA上集積に働くTop1結合タンパク質について論文を発表した。また、APE1について世界で始めて遺伝子座特異的なabasic site形成を評価する方法を開発した。b） CH12 細胞の抗体遺伝子S領域にLexA 結合サイトを導入した細胞から、DNA修復に貢献する新たな因子の機能を進めている。
３）AIDによる特異的なDNA修復機構の解明:AIDの共役因子hnRNP L遺伝子C末端にHAタグが挿入された293T細胞を樹立しhnRNP L とAIDの連続免疫沈降実験の条件を整え、順調に網羅的なシーケンスの準備をしている。また、新規にDNA修復過程に関わるヒストン関連因子の機能解析を終え、結果を投稿中である。AIDのドメイン構造と二量体形成についてBimolecular fluorescence complementation (BiFC)法とグリセロール勾配を用いた分画法により解析を行い、N末およびC末のドメイン構造とその二量体形成、DNA切断と修復過程との関連を明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) AID によるTop1 mRNA の翻訳制御機能の解明： 抗FLAG抗体の結果と抗HA抗体で各々の免疫沈降で得られたタンパク質-RNA複合体を安定的に回収可能となり、hnRNP Kの特異的な結合RNAの濃縮に成功したことから、現在次世代シーケンス法で解析を進めている。AIDの構造解析については、数種類のRNA結合タンパク質で結晶化が可能か否かを検討する。また、標的RNAがhnRNP KまたはhnRNP LとAID複合体の免疫沈降から同定された場合には、RNAをも含む三者で構造解析を試みる。
2) Top1 によるDNA 切断ターゲットの特異性決定機構の解明:LexA結合サイトを挿入した細胞のSILAC法による抗体遺伝子特異的なタンパク質同定から得られたDNA修復関連因子について機能解析を進める。DNA切断関連因子についてスクリーニングを進める。
3) AIDによる特異的なDNA修復機構の解明: Top1と相互作用するタンパク質の同定においてはAPE１に関する論文を投稿中であるため、これを完成させる。AID, hnRNP Lとの連続免疫沈降により編集RNAを同定する。
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