2015 Fiscal Year Annual Research Report
四肢および歯の発生におけるBMPシグナリングの機能解析
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15H06423
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
早野 暁 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (20633712)
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| Project Period (FY) |
2015-08-28 – 2017-03-31
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| Keywords | プログラム細胞死 / BMP / p53 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度に実施した研究成果として、野生型マウス胎生14日目・16日目・18日目の下顎臼歯を用いたp53細胞死経路の活性化について調べた。方法としては、胎生14日目・16日目・18日目野生型マウス胎児から下顎骨を単離し、実験群として、p53の特異的阻害薬であるPifithrin-αを添加した培養液を用いた器官培養を行った。その後、Pifithrin-α非添加群である対照群と実験群の歯冠形態を比較した。この結果、実験群では歯冠形態の異常が見られた。しかし、その形態異常の程度は一定ではなく、個体間で差があった。次に、この形態異常がp53細胞死経路の抑制によるものであることを調べるために、器官培養後の組織を用いて分子レベルでの解析を行った。方法としては、器官培養した下顎臼歯からmRNAを抽出し、逆転写法を用いてmRNAからDNAを精製した後、リアルタイムPCR法を用いてp53細胞死経路の活性化に関わる遺伝子の発現量を実験群と対照群とで比較した。その結果、Pifithrin-α添加群ではp53細胞死経路の活性化が優位に抑制されることが分かった。
次に、BMPシグナリングとp53細胞死経路の関係を調べるため、遺伝子改変マウスの組織を用いた実験を行った。方法としては、神経堤細胞特異的にBMPシグナリングを亢進させたコンディショナルノックインマウス(caBmpr1a:P0-Cre mouse)歯胚、および、同腹子コントロールマウス歯胚のパラフィン切片を作成し、免疫染色法を用いてp53細胞死経路の活性に関わる分子の産生量を両者で比較した。その結果、発生中のcaBmpr1a:P0-Cre mouseマウス歯胚において、p53細胞死経路に関わるタンパクの産生が亢進している傾向が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、組織発生におけるプログラム細胞死が、これら組織の形態形成にどの様に関与するかを、また、BMPシグナリングがこのプログラム細胞死を介した組織の形態形成にどの様に関与するかを明らかにするものである。この目標を達成するために、平成27年度の研究計画では、組織の発生において認められる細胞死あるいは細胞増殖の抑制がBMPシグナリングを介したp53 経路の活性に由来するかどうかを明らかにし、平成28年度の研究計画では、特異的阻害剤を用いたBMP-Smad シグナリングあるいはp53 経路の抑制が組織発生に与える影響を明らかにすることを予定していた。平成27年度の研究計画についてはp53特異的阻害薬を用いた実験により、プログラム細胞死と組織形成の関連を調べ、コンディショナルノックインマウスを用いた実験により、BMPシグナリングと、組織形成におけるプログラム細胞死との関連を調べた。これらのことから、この研究については順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の研究の具体的な目的としては、平成27年度の研究結果から得られた結果をもとに、BMPシグナリング、あるいは、p53細胞死経路を修飾することにより、組織に生じる形態形成の異常の改善をin vitroおよびin vivoにおいて試みることである。この目的を遂行するために、BMPシグナリング阻害薬、あるいは、p53特異的阻害薬を用いた器官培養を行う予定である。この実験に先立ち、器官培養でこれらのタンパクを使用するための最適条件をさがし、安定した器官培養の系を確立する必要がある。予定どおりに器官培養を行うことができれば、培養した組織を用いて、平成27年度の研究方法と同様に目的のタンパク、あるいは、mRNAの発現量を、試薬添加群および対照群で比較する。
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