異常な形態へ変化したクラミジアの特徴解析による新規治療薬の標的分子探索

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H06649
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 黒木 香澄 (石田香澄) 東京大学, 農学生命科学研究科, 特任助教 (80760272)
• Project Period (FY): 2015-08-28 – 2018-03-31
• Keywords: クラミジア / 慢性感染 / III型分泌装置 / リソソーム

Outline of Annual Research Achievements

クラミジアの慢性感染は不妊の原因ともなる骨盤内炎症性疾患や粥状動脈硬化症などを引き起こすことが示唆されている。慢性感染の原因の一つとして考えられるのがクラミジア菌体のaberrant body（以下AB）への移行である。クラミジアはペニシリン等の抗菌剤投与、炎症促進性サイトカインであるIFN-γの曝露によって感染性や増殖能を失ったABへと変化し長期間宿主細胞内で生存すると考えられるが、通常のクラミジアと同様にリソソームによる消化を回避するのか等、宿主細胞内でどのような挙動を示すかについてはわかっていない。本研究ではクラミジアの慢性感染に対する新たな治療法や予防法を確立するため、細胞内におけるABの動態を明らかにする。平成27年度にはペニシリン誘導性のABが感染する細胞では通常のクラミジア感染細胞に比べてリソソームマーカーであるLAMP1の発現量が増加することを蛍光免疫染色法にて明らかにした。これを受け、平成28年度にはRT-PCRでlamp1遺伝子の発現量を確認したところ、やはりペニシリン誘導性のAB感染細胞では通常のクラミジア感染細胞に比べて感染直後のlamp1遺伝子の発現量は高かった。さらに16S rRNAの発現量を指標にクラミジアの細胞内における生存性をRT-PCRで確認すると、ペニシリン存在下のクラミジアは感染96時間後の生存性がIFN-γ存在下または通常のクラミジアに比べて低い傾向にあった。これらの原因を探るべく、膜へと移行するクラミジアIII型分泌装置のエフェクター蛋白質をピックアップし、それらの遺伝子発現量をRT-PCRで解析した結果、通常のクラミジアとペニシリンまたはIFN-γによって誘導されたABでは発現パターンが大きく異なることが示唆された。以上の研究結果から、クラミジアはペニシリンやIFN-γに曝露されることでIII型分泌装置のエフェクター蛋白質の発現に変化を生じ、細胞内における生存性に影響する可能性が明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画に従い、これまでにペニシリンまたはIFN-γによるクラミジアのaberrant body（以下AB）への移行条件の検討と確立、蛍光免疫染色によるABの細胞内局在の解析、ABのIII型分泌装置エフェクター蛋白質の発現解析等を行ってきた。それらの解析により、まずABは通常のクラミジアと同様に細胞内で膜構造の中に局在するが、誘導剤の種類によって膜構造や菌体の大きさが異なることがわかった。次にペニシリン誘導性のABが感染する細胞では通常のクラミジア感染細胞に比べてリソソームマーカーであるLAMP1の発現量が増加する可能性を蛍光免疫染色法とRT-PCRで明らかにした。さらに、ペニシリン誘導性のABはIFN-γ誘導性のABまたは通常のクラミジアに比べて細胞内での生存性が低い傾向にあることを確認した。また、クラミジアIII型分泌装置のエフェクター蛋白質の遺伝子発現をRT-PCRで解析したところ、通常のクラミジアとペニシリンまたはIFN-γによって誘導されたABでは発現パターンが大きく異なることにあることが示唆された。これらの結果から、ペニシリンやIFN-γに曝露されたクラミジアはABへ移行するとともにIII型分泌装置のエフェクター蛋白質の発現に変化を生じることで、細胞内生存性に影響する可能性が明らかとなった。以上の成果により、本研究課題の進捗状況を「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究実績を踏まえ、今後は以下について明らかにすべく研究を推進する。
１、ペニシリンによって誘導されたクラミジアのaberrant body（以下AB）はリソソームによる消化を免れることができないのか？
２、何故ペニシリンによって誘導されたABはリソソームによる消化を免れることができないのか？

これまでの研究結果からペニシリン誘導性のABが感染する細胞ではLAMP1の発現が高くなることが示唆される。しかしながらリソソームやエンドソームとABの細胞内における相互関係については明らかにできていない。そこで上記１について明らかにするために平成27年度に確立したリソソームまたはエンドソームマーカーを過剰発現するヒト株化細胞を用いてペニシリン誘導性ABの細胞内局在を共焦点顕微鏡で観察する。また蛍光免疫染色法でも同様に観察し、ペニシリン誘導性ABがリソソーム消化を受けるかどうか解析する。また、クラミジアの宿主細胞内での生存にはIII型分泌装置から分泌されるエフェクター蛋白質が必須であり、これらの蛋白質がリソソームとクラミジアの融合を阻止するのに働くと予想されている。そこで上記2について明らかにすべく、ペニシリンによって誘導されたABで発現低下または上昇が認められたエフェクター蛋白質をピックアップし（CT228、CT232、CT365、CT849など）、それらの機能について解析する。具体的にはこれらの蛋白質をHeLa細胞などのヒト株化細胞に強制発現させ、これらの細胞内におけるペニシリン誘導性ABの局在や生存性を明らかにする。またペニシリン誘導性ABで発現低下していたエフェクター蛋白質を過剰発現するクラミジア株を作製し、ペニシリン存在下でのクラミジアの細胞内局在や生存性を確認する。これらの実験によりペニシリン誘導性ABがリソソーム融合を回避できないメカニズム、さらに通常クラミジアがリソソーム融合から逃れるのに必要なエフェクター蛋白質を明らかにする。