HP1BP3が形成するクロマチン高次基盤構造の立体構造解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H06692
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 小山 昌子 早稲田大学, 理工学術院, 研究員 (40755097)
• Project Period (FY): 2015-08-28 – 2017-03-31
• Keywords: クロマチン / ヌクレオソーム / リンカーヒストン

Outline of Annual Research Achievements

真核細胞の核内では、長大なDNAが４種類のコアヒストン（H2A, H2B, H3, H4）二分子ずつから成るヒストン八量体に巻き付いて直径10 nmのヌクレオソーム線維を形成している。遺伝子転写が抑制されているヘテロクロマチン領域においては、このヌクレオソーム線維が規則正しく折り畳まれ、直径30 nmや数十nmの高次の線維構造が形成されているというのが長年信じられてきた定説であった。しかし最新の研究により、核内のクロマチンは長大なヌクレオソーム線維が規則正しく高度に凝縮した線維状の構造体として存在するのではなく、数個から十数個という比較的少数のヌクレオソームから成るいくつかの高次基盤構造の組み合わせで構成されることが示唆されている。高次基盤構造形成においては、H1ファミリーに属するリンカーヒストンが重要な役割を果たすと考えられている。本研究では、ヌクレオソームがリンカーヒストンなどと協同して構築する高次基盤構造の立体構造を明らかにし、転写因子などのクロマチン結合蛋白質が作用するメカニズムを構造生物学的に明らかにすることを目的としている。
本年度は、リンカーヒストンHP1BP3のコンストラクト構築および大腸菌発現系による発現および精製の条件検討を行った。さらに、高次基盤構造に作用してクロマチンの構造変換を引き起こすと考えられる転写因子のいくつかをクローニングし、大量発現と高純度での精製が可能な系を確立して、ターゲットとなるヌクレオソームを用いて生化学的解析を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全長のリンカーヒストンHP1BP3の大腸菌発現系での大量発現が当初予想していたよりも難しく、さまざまなベクターや大腸菌株を用い、また分子シャペロンや可溶化タグとの融合蛋白質としての発現も試みたものの、構造解析に十分な量での高純度精製には現在までのところ到達していない。しかしながら、標的ヌクレオソームの再構成に成功し、またDNA長の最適化も行った。さらに、数種類の転写因子について大腸菌を用いた発現系の構築を行い、大量精製系の確立に成功した。これらの標的ヌクレオソームと転写因子を用いた生化学的解析を行って、いくつかの重要な知見を得ることができた。

Strategy for Future Research Activity

大腸菌発現系用にコドンを最適化した遺伝子配列を用いてHP1BP3の発現検討を行う。また、大腸菌以外の発現系（主に無細胞発現系）を用いることにより、HP1BP3の発現精製を試みる。さらに、さまざまなヌクレオソームの試験管内再構成もひきつづき行い、HP1BP3とヌクレオソームの複合体（クロマチンの高次基盤構造）を精製して、X線結晶解析やX線小角散乱、クライオ電子顕微鏡による構造生物学的解析を行う。クロマチンの高次基盤構造に対する転写因子の作用機序を解明するために、転写因子とヌクレオソーム（あるいはクロマチン高次基盤構造）を用いた生化学的解析、物理化学的解析および構造生物学的解析をひきつづき行う。