Investigation of molecular mechanism of transphosphorylation by a phosphatidylinositol kinase

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H06855
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 佐藤 友美 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 博士研究員 (20759211)
• Project Period (FY): 2015-08-28 – 2017-03-31
• Keywords: 構造生物学 / キナーゼ / 相互作用解析 / イノシトールリン脂質 / 結晶化 / PI5P4K / リン酸化反応機構 / X線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、イノシトールリン脂質キナーゼ(PIPK)による基質のリン酸化反応機構を明らかにすることを目的としている。昨年度は、リポソーム存在下でのPI5Pとの結合の解析を行い、リン脂質(PI5P)とPI5P4Kβとの結合自体は弱く、周りの脂質との相互作用の寄与が大きいことを示唆するデータが得られていた。従って、PIPKによる基質のリン酸化反応機構を明らかにするためには、結晶化のみならず基質やヌクレオチドとの結合を詳細に解析しながら、多角的に研究を進める必要があると考えられた。そこで本年度は、以下の3点の研究を進めた。
(1)ヌクレオチドとのPI5P4βの結合の測定　PI5P4Kβとヌクレオチドやイノシトールリン脂質との結合を測定するため、SPR解析による結合測定を試みた。PI5P4Kβをアミンカップリングにてセンサーチップに固定化し、複数種類のヌクレオチドとの結合を異なる塩濃度条件下にて測定したが、結合定数は0.6-3.0 mM程度でありキナーゼアッセイのKm(約0.1 mM)よりも著しく大きかった。
(2) 阻害剤との複合体の結晶構造解析　PI5P4Kβの酵素反応阻害機構を生化学実験と併せて立体構造的に理解することにより、本来の反応機構の解明に役立てるために阻害剤との複合体の結晶構造解析を行った。スクリーニングによって得られた6種類の阻害剤との複合体の結晶構造解析を試み、データセットを取得した。このうち、3種類については化合物の電子密度が観測された。
(3)PI5P4Kα/γの結晶化　サブタイプの構造から、酵素活性の違いを立体構造的に理解することで反応機構の理解を進めるため、PI5P4KαおよびPI5P4Kγの結晶化を試みた。結晶化の初期スクリーニングを行ったところ、PI5P4Kαに関しては微結晶が得られたが、PI5P4Kγに関しては結晶が得られなかった。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。