四肢形成時のｓｈｈシグナル作用領域と長い糸状仮足の関係と特性

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J00516
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 浜田 裕貴 東北大学, 生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: パターン形成 / サイズ調節 / 濃度勾配 / 細胞形態 / 細胞系譜追跡

Outline of Annual Research Achievements

本年度は主に魚類ゼブラフィッシュの胸鰭の基底部分と先端部分、そして両生類イベリアトゲイモリの前肢の初期発生時と前肢再生時に、一般的に四肢の前後のパターン形成に重要なソニックヘッジホッグ（以後Shh）遺伝子の局所的な発現と生産されたShhがどれだけの範囲に勾配を持って広がっているかの状況について、これらの組織の遺伝子発現の状況及びこれらの生物の遺伝子組み換え個体を作製から解析しようと試みた。
ゼブラフィッシュの解析では胸鰭基部側（担鰭骨領域）にShh遺伝子及びその下流で働く遺伝子の発現は見られたものの胸鰭先端側（鰭条骨領域）は骨格が形成されるまでこれら前後のパターンを形成するための遺伝子の発現は見られなかった。一方で先端部分の骨格パターンを多数の個体間で比較した結果、先端部分にもはっきりとした前後パターンが発生の早い段階で形成されていることが確認された。今後は遺伝子組み換え個体を用いた細胞系譜の追跡実験からこれらの矛盾がどのように解消されるか解析する予定である。
イベリアトゲイモリの解析では、初期発生時の肢芽と前肢切断後に再生時に形成される再生芽においてShh遺伝子とその下流で働く遺伝子の発現をまず比べた。初期発生時の発現様式はShh遺伝子の発現は他の四足類同様の後方局在を示したが、その下流で働く遺伝子の範囲に違いが見られた。再生芽では発現のパターンは初期発生のものと大きく変わらなかったもののそれぞれが発現されている領域は、大きさに応じて変化している様子が観察された。今後は、遺伝子組み換え個体を用いた細胞系譜追跡の実験からこれらの発現範囲の違いが初期発生と再生で形成される前肢のパターンの違いにつながっていることを確かめたい。また、遺伝子組み換え個体を用いてこれらの範囲の違いに肢芽を構成する細胞の持つ細い糸状仮足がどのように影響しているかを観察する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ゼブラフィッシュのShhおよびその下流遺伝子の発現を初期胚以前の研究で知られていた通り担鰭骨領域には見られたものの、期待していた鰭条骨領域での発現は見られなかった。しかしながら、同時に行っていた鰭条骨の前後軸パターンの観察では鰭条骨は担鰭骨領域から半ば独立した形態形成をしていることがわかった。（この結果については論文にまとめて投稿を準備中）また、遺伝子組み換えにより胸鰭の細胞系譜と細胞形態を観察する事ができる系を用意した。
イベリアトゲイモリのShh及びその下流遺伝子の発現を初期発生時の肢芽と成長後の前肢を切断した際に形成される再生芽について解析した。肢芽での発現は順調にデータが集まり組織切片を用いた解析からどの程度の範囲（細胞数）に発現が広まっているのかを調べることができた。一方再生芽の場合には、切断後何日目の時点で前後軸に関わるShh関連遺伝子の発現が見られるようになるのかが判明していなかったので、まず時系列的に追った遺伝子発現の解析を行う必要があり、その解析を行い再生後の特定の時期（ステージ）に肢芽と同様なShh関連遺伝子の発現があることがわかり、現在この遺伝子発現の範囲と再生芽の組織の大きさとの関連を調べるため、試行を重ねている。
イベリアトゲイモリについても遺伝子組み換え個体の作製を行っていたが、遺伝子組み換えの導入効率が想定していたよりも低く、当初予定していた遺伝子組み換え第1世代を用いた実験が難しく、大量に遺伝子組み換え個体を得られる子世代での解析を行うこととして予定を後倒しにした。

Strategy for Future Research Activity

これまでの実験により生物種間で肢芽前後軸に関わるShh関連遺伝子の発現の様式は同じであるもののその発現範囲が肢芽の大きさに応じる形で広がっている様子が確認できた。現在イモリの初期発生と再生芽においても同様の関係が見られるかについて検証中である。本年度までに再生でShh関連遺伝子の発現が始まる時期を特定できたので、様々な大きさの個体の再生芽比較しShh関連遺伝子の発現が組織の大きさに比例しているかを調べる予定である。
また、当該年度までに作製を完了した遺伝子組み換えゼブラフィッシュ及びイベリアトゲイモリを用いて、Shh関連遺伝子の発現が初期発生時と再生時で同じ位置情報を指示すために使われているのかを調べる予定である。更にこれらの実験系において肢芽及び再生芽の細胞形態を調べこれらが、ニワトリまたはマウスの初期発生肢芽に見られたような長い糸状仮足を持っているのか、また持っているとしたらどのような違いがあるのかを観察したい。特にイベリアトゲイモリについては初期発生肢芽と再生芽における長い糸状仮足構造の違いがあるのかを比較したい。
更にイベリアトゲイモリの長い糸状仮足の形態に差が見られた場合にはその原因となる遺伝子を初期発生肢芽と再生芽の遺伝子発現量を次世代シークエンサー解析から明らかにしたいと考えている。

Research Products

• [Presentation] Whether fin rays of pectoral fin have a certain pattern or not? (2016)
  • Author(s): Hiroki Hamada, Yuuki Honda, Toshiaki Uemoto, Keiichi Kitajima, Tetsuya Umeda, Ryoutarou Kumagami, Gembu Abe, and Koji Tamura
  • Organizer: Joint Events of 22nd International Congress of Zoology and 87th Meeting of Zoological Society of Japan
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター
  • Year and Date: 2016-10-14 – 2016-10-19
  • Int'l Joint Research