腸管上皮－間質ニッチの包括的理解と自己補完的組織培養技術の確立

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J00981
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 杉本 真也 慶應義塾大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: オルガノイド / 腸管上皮幹細胞 / 炎症性腸疾患 / 粘膜再生治療 / 間質細胞

Outline of Annual Research Achievements

今年度は，in vitro系における間質細胞ニッチの検討に基づく理解から昨年度成功に至った，免疫不全マウスにおけるヒトオルガノイド同所異種移植，および大動物における内視鏡的なオルガノイド自家移植系のさらなる最適化を行った．
移植細胞においては，培地の無血清化のため，Wnt-3aを無血清Wntタンパク質複合体に置換し，また，効率的に大量の細胞を培養する手法の開発に成功した．レシピエントマウスにおいては，EDTAによる腸管上皮欠損モデルを改良することにより，生存率および生着率を向上させ，同所異種移植系を安定化することに成功した．これらの手法の改変により，ヒト腸管上皮オルガノイド（正常細胞および腫瘍細胞）の広範な同所異種移植の長期生着を達成した．正常オルガノイドは腫瘍化せず半年以上生着することを内視鏡下での経時的観察において確認できたのに対し，コントロールとして用いた腫瘍オルガノイドでは，腫瘍の経時的な増大が確認できた．これまで，間質との共移植によって移植効率化を図ることを目指してきたが，移植手法の改良により腸管上皮オルガノイド単独での効率的な同所異種移植が達成され，レシピエントとなるマウスの間質細胞から供給されるニッチ因子によって，ヒトのドナー幹細胞がマウス腸管内に生着しうることが明らかとなった．さらに，移植オルガノイドに対してCRISPR/Cas9による遺伝子改変技術を用いて，ヒト腸管上皮幹細胞マーカーであるLGR5の機能的な存在確認を行った．また，マイクロミニピッグの腸管上皮オルガノイド移植においても，内視鏡下のGFP蛍光の経時的観察に加え，病理組織学的な1か月以上の生着を確認しえた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では，レシピエントマウスモデルの改変および，培養細胞の最適化によって，ヒト腸管上皮オルガノイドの免疫不全マウスへの同所異種移植の長期生着に成功した．間質との共移植によって移植効率化を図ることを目指してきたが，移植手法の改良により腸管上皮オルガノイド単独での効率的な同所異種移植が達成されたため，当初計画からは一部方向性の転換をはかることとなった．この移植モデル確立の結果，遺伝子改変オルガノイドの移植により，これまでヒトにおいてはモデルが存在しないために成しえなかった，ヒトのLGR5の機能解析を行うステップへすすむことができた．現在投稿準備中であり，研究は順調な進展をみせている．

Strategy for Future Research Activity

マウスの腸内において，ヒトの幹細胞とマウスの幹細胞における差異を観察し，ニッチ因子との関連につき，検討を加えていく．また，分化細胞マーカーであるKRT20の解析を加えることにより，腸管におけるヒトの細胞の挙動をさらに詳細に解析する．
マイクロミニピッグへの移植に際しては，必要となる細胞の低減および移植効率の向上のため，移植部位に細胞を停留させる移植手法を試みる．また，Xeno-free化のため，移植時に用いる細胞外基質を変更し，さらに条件の最適化を行っていく．

Research Products

• [Journal Article] Single fecal microbiota transplantation failed to change intestinal microbiota and had limited effectiveness against ulcerative colitis in Japanese patients. (2017)
  • Author(s): Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Katsuyoshi Matsuoka, Keiichiro Saigusa, Keiko Ono, Mari Arai, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Moeko Nakashima, Kozue Takeshita, Makoto Naganuma, Wataru Suda, Masahira Hattori, Takanori Kanai
  • Journal Title: Intestinal Research Volume: 15 Pages: 68-74
  • DOI: 10.5217/ir.2017.15.1.68
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Endoscopic morphologic features of ulcerative colitis-associated dysplasia classified according to the SCENIC consensus statement. (2017)
  • Author(s): Shinya Sugimoto, Makoto Naganuma, Yasushi Iwao, Katsuyoshi Matsuoka, Masayuki Shimoda, Shuji Mikami, Shinta Mizuno, Yoshihiro Nakazato, Kosaku Nanki, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Takanori Kanai
  • Journal Title: Gastrointestinal Endoscopy Volume: 85 Pages: 639-646
  • DOI: 10.1016/j.gie.2016.11.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ulcerative colitis endoscopic index of severity is associated with long-term prognosis in ulcerative colitis patients treated with infliximab. (2016)
  • Author(s): Keiichiro Saigusa, Katsuyoshi Matsuoka, Shinya Sugimoto, Mari Arai, Hiroki Kiyohara, Kozue Takeshita, Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Kiyoto Mori, Yoshihiro Nakazato, Tomoharu Yajima, Makoto Naganuma, Tadakazu Hisamatsu, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • Journal Title: Digestive Endoscopy Volume: 28 Pages: 665-670
  • DOI: 10.1111/den.12655
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity is Useful to Predict Medium- to Long-Term Prognosis in Ulcerative Colitis Patients with Clinical Remission. (2016)
  • Author(s): Mari Arai, Makoto Naganuma, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Keiko Ono, Kiyoto Mori, Keiichiro Saigusa, Kosaku Nanki, Makoto Mutaguchi, Shinta Mizuno, Rieko Bessho, Yoshihiro Nakazato, Naoki Hosoe, Katsuyoshi Matsuoka, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • Journal Title: Journal of Crohn's and Colitis Volume: 10 Pages: 1303-1309
  • DOI: 10.1093/ecco-jcc/jjw104
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Indole compounds may be promising medicines for ulcerative colitis. (2016)
  • Author(s): Shinya Sugimoto, Makoto Naganuma, Takanori Kanai
  • Journal Title: Journal of Gastroenterology Volume: 51 Pages: 853-861
  • DOI: 10.1007/s00535-016-1220-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recent trends and future directions for the medical treatment of ulcerative colitis. (2016)
  • Author(s): Makoto Naganuma, Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Shinya Sugimoto, Takanori Kanai
  • Journal Title: Clinical Journal of Gastroenterology Volume: 9 Pages: 329-336
  • DOI: 10.1007/s12328-016-0686-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Stem Cell Research and Treatment: From Bench to Clinical Practice. (2017)
  • Author(s): Shinya Sugimoto
  • Organizer: The 1st Basic Science Research Workshop: Evolving Basic Science in Intestinal Diseases
  • Place of Presentation: Seoul, Korea
  • Year and Date: 2017-02-10 – 2017-02-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 腸管上皮オルガノイドを用いた幹細胞移植技術の確立 (2016)
  • Author(s): 杉本 真也, 金井 隆典, 佐藤 俊朗
  • Organizer: 第58回日本消化器病学会大会（JDDW2016）
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2016-11-04 – 2016-11-04
• [Presentation] Cultivation of human norovirus using human duodenal organoids. (2016)
  • Author(s): Akira Fujimoto, Kei Haga, Shinya Sugimoto, Toshiro Sato, Yen Hai Doan, Motohiro Miki, Reiko Takai-Todaka, Kazuhiko Katayama
  • Organizer: The 64th Annual Meeting of the Japanese Society for Virology.
  • Place of Presentation: Sapporo Convention Center（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-10-24 – 2016-10-24
• [Presentation] Gut environments and human colorectal carcinogenesis. (2016)
  • Author(s): Toshiro Sato, Shinya Sugimoto, Mami Matano
  • Organizer: The 75th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association.
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-08 – 2016-10-08
• [Presentation] Efficacy and safety of fecal microbiota transplantation on ulcerative colitis. (2016)
  • Author(s): Shinta Mizuno, Kosaku Nanki, Katsuyoshi Matsuoka, Keiko Ono, Makoto Mutaguchi, Mari Arai, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Kozue Takeshita, Makoto Naganuma, Takanori Kanai
  • Organizer: The 4th Annual Meeting of Asian Organization for Crohn's and Colitis (AOCC)
  • Place of Presentation: Kyoto International Conference Center（京都府左京区）
  • Year and Date: 2016-07-07 – 2016-07-07
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Investigation of Medium- to Long-Term Prognosis of Ulcerative Colitis Patients Using Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity (UCEIS). (2016)
  • Author(s): Mari Arai, Makoto Naganuma, Shinya Sugimoto, Hiroki Kiyohara, Keiko Ohno, Kiyoto Mori, Kosaku Nanki, Makoto Mutaguchi, Shinta Mizuno, Rieko Bessho, Yoshihiro Nakazato, Nagamu Inoue, Haruhiko Ogata, Yasushi Iwao, Takanori Kanai
  • Organizer: Digestive Disease Week (DDW) 2016
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 2016-05-21 – 2016-05-21
  • Int'l Joint Research