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2015 Fiscal Year Annual Research Report

酵母新規応答型プロモーターの開発によるアルギン酸からの効率的なエタノール発酵

Research Project

Project/Area Number 15J01303
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

高木 俊幸  京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)

Project Period (FY) 2015-04-24 – 2017-03-31
Keywords酵母 / アーミング技術 / 細胞表層工学 / 海洋バイオマス / 褐藻 / Saccharophagus degradans / 定量プロテオーム解析 / アルギン酸リアーゼ
Outline of Annual Research Achievements

①Saccharophagus degradansの定量プロテオーム解析とアルギン酸資化経路予測
これまでの研究で行った定量プロテオーム解析の結果を踏まえて、S. degradansのアルギン酸資化経路の予測を行った。特に、アルギン酸分解単糖であるDEHを資化するための最初の酵素であるDEH reductase(DehR)を同定するために、DehR候補遺伝子の大腸菌での異種発現系を構築し、DehR活性検出に成功した。さらに、S. degradansのゲノム情報を活用することで、DEHからピルビン酸まで代謝経路を予測した。
②Endo型・Exo型アルギン酸リアーゼ共提示酵母とDEH資化酵母の作製
S. degradans由来Endo型アルギン酸リアーゼとExo型アルギン酸リアーゼを一つの酵母の細胞表層に提示させるためのプラスミド構築を行った。それぞれのタンパク質をFLAG tag及びStrep tagと融合発現することで、Endo型・Exo型アルギン酸リアーゼが一つの酵母の細胞表層に提示されていることを確認した。さらにpHや温度などの反応条件を最適化することで、Endo型・Exo型アルギン酸リアーゼ共提示酵母によるアルギン酸の効率的な分解に成功した。
DEH資化酵母作製のために、プロテオーム解析と代謝酵素機能解析によって同定に成功したS. degradans由来のDEH代謝酵素遺伝子を酵母に異種発現させた。DEH代謝酵素遺伝子は酵母にコドンを最適化して、プロテインタグと融合発現した。さらに、これまでの報告を参考にして、DEHトランスポーター遺伝子を人工合成し、EGFPと融合発現することで細胞膜への局在を確かめた。現在、DEHトランスポーター及び代謝酵素遺伝子をすべて一つの酵母に導入後、DEHを唯一の炭素源とする培地で培養することで、DEHを資化することを確かめている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、当初予定していたEndo型・Exo型アルギン酸リアーゼ共提示酵母の作製を完了した。また、DEHトランスポーター及びDEH代謝酵素遺伝子を全て一つの酵母にゲノム挿入し、機能解析した。

Strategy for Future Research Activity

作製した酵母を用いて、アルギン酸からのエタノール発酵を行う予定である。生育阻害などが確認された場合、当初の計画通りストレス応答性のプロモーター開発によって細胞ストレスを制御するシステムを構築する予定である。

  • Research Products

    (5 results)

All 2016 2015

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Acknowledgement Compliant: 2 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Putative alginate assimilation process of the marine bacterium Saccharophagus degradans 2-40 based on quantitative proteomic analysis2016

    • Author(s)
      Toshiyuki Takagi, Hironobu Morisaka, Shunsuke Aburaya, Yohei Tatsukami, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda
    • Journal Title

      Marine Biotechnology

      Volume: 18 Pages: 15-23

    • DOI

      10.1007/s10126-015-9667-3

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Engineered yeast whole-cell biocatalyst for direct degradation of alginate from macroalgae and production of non-commercialized useful monosaccharide from alginate2016

    • Author(s)
      Toshiyuki Takagi, Takahiro Yokoi, Toshiyuki Shibata, Hironobu Morisaka, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda
    • Journal Title

      Applied Microbiology and Biotechnology

      Volume: 100 Pages: 1723-1732

    • DOI

      10.1007/s00253-015-7035-x

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Construction of genome designed yeasts for direct assimilation of macroalgae by synthetic biology2015

    • Author(s)
      Toshiyuki Takagi, Yusuke Sasaki, Keisuke Motone, Hironobu Morisaka, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda
    • Organizer
      Pacifichem2015
    • Place of Presentation
      Honolulu, HI, USA
    • Year and Date
      2015-12-15 – 2015-12-20
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Saccharophagus degradansのアルギン酸資化メカニズムの解析2015

    • Author(s)
      高木俊幸, 森坂裕信, 油屋駿介, 立上陽平, 黒田浩一, 植田充美
    • Organizer
      2015年度生物工学若手研究者の集い 夏のセミナー
    • Place of Presentation
      名古屋
    • Year and Date
      2015-07-11 – 2015-07-12
  • [Presentation] Molecular breeding of yeast co-displaying endo- and exo-type alginate lyases to completely utilize macroalgae2015

    • Author(s)
      Toshiyuki Takagi, Toshiyuki Shibata, Hironobu Morisaka, Kouichi Kuroda, Mitsuyoshi Ueda
    • Organizer
      FEMS2015, 6th Congress of European Microbiologists
    • Place of Presentation
      Maastricht, Netherland
    • Year and Date
      2015-06-07 – 2015-06-11
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2016-12-27  

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