2015 Fiscal Year Annual Research Report

幹細胞マーカーＥｐＣＡＭを用いた肝発癌モデルの樹立とゲノム／エピゲノム異常の解析

Research Project

Project/Area Number	15J01616
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	竹田治彦京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2015-04-24 – 2018-03-31
Keywords	癌幹細胞 / 肝癌 / EpCAM / AID / 発癌メカニズム
Outline of Annual Research Achievements	肝癌は臨床的に極めて難治癌であるが、極めて難治たらしめている原因として癌幹細胞の存在が提唱されている。その癌幹細胞からの肝発癌メカニズムを明らかにするというコンセプトで研究を開始した。具体的には、肝臓の幹細胞/前駆細胞や消化管上皮に存在するEpCAM陽性細胞にヒトの遺伝子編集酵素であるAIDを特異的に発現させることにより、消化器組織の幹細胞に遺伝子異常が生じることが肝癌を初めとする消化器癌の発癌につながるか否かを明らかにすることを目的として、研究を進めてきた。まず、計画通り、AIDにタモキシフェン受容体であるERT2を結合したAID-ERT2コンストラクトを作成した。さらに、同コンストラクトをEpCAMプロモータ―の下流にknock inすることで、EpCAM発現細胞に特異的にAID-ERT2融合蛋白を発現するEpCAM-AID-ERT2マウスを作成した。同マウスでは、細胞質に発現したAID-ERT2はタモキシフェン投与にて核内に移行し、核内でAIDが機能することが期待され、生後タモキシフェンを投与することで、任意の時期にAIDのゲノム異常の誘導作用をEpCAM陽性細胞に選択的に機能開始させることができると考えられた。誕生したマウスをSPF領域で飼育し、野生型マウスとの交配を行い、4週齢前後でジェノタイピングを行い、EpCAM-AID-ERT2のアレルを有するマウスが誕生したことを確認した。 AIDの作用による発癌率の違いを検討するため、EpCAM-AID-ERT2マウスにタモキシフェン投与群、EpCAM-AID-ERT2マウスに通常餌投与群、野生型マウスにタモキシフェン投与群、とコントロールを設定し、それぞれ10-20匹ずつを現在経過観察中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画通り、目的とするAID-ERT2コンストラクトの作成、EpCAM-AID-ERT2マウスの作成を行い、ジェノタイピングにて目的の遺伝子発現を伴うマウスが誕生したことを確認した。AID-ERT2が細胞質に発現していることを組織免疫染色法を用いて確認した。交配を重ね、十分な個体数を確保して飼育中である。タモキシフェンを投与する発癌モデルの作成において、給餌方法の検討を経て、順調に、タモキシフェンを経口投与にてAIDを核内で機能させるモデルを作成し、コントロールの野生型マウスとともに経過観察中である。腫瘍発生有無の比較を検討しているが、当初の予定通り、発癌には72週程度の時間を要すると、先行研究などから推測され、現時点では腫瘍発生率の比較などはできていない。二年度の途中で予定の週齢に達するマウスが誕生するため、発癌率について検討する予定である。また、週齢が早い段階での肝胆膵組織を検討する予定であったが、個体数を確保するために十分な組織の採取、解析はできていない。十分な個体数を確保した上で、二年目の課題とする。
Strategy for Future Research Activity	発癌率をEpCAM-AIDERマウスと野生型、タモキシフェン投与と普通食投与で比較検討していくため、統計学的な有意差を得るために、さらに経過観察の個体数を増やす予定である。また72週～90週に達したマウスから順にsacrificeして、癌発生有無について検討を行っていく予定である。また、週齢ごとに肝胆膵組織の障害有無などを検討する。 EpCAM-AID-ERT2マウスの肝臓、膵臓、腸管などの臓器に癌の発生が確認できれば、癌組織および非癌組織と野生型マウスの該当臓器の同部位組織から抽出したDNAを用いて、次世代シーケンサーを使用した遺伝子変化の網羅的解析を行う。これらの検討により、癌幹細胞に特徴的なゲノム変化を特定できれば、癌幹細胞を標的とした治療へ発展させていく可能性が考えられる。