細胞周期制御因子とトランスポゾンの組合せによる高品質なブタｉＰＳ細胞の樹立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J02085
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 土内 憲一郎 東北大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ブタ / 細胞周期 / 遺伝子導入 / リプログラミング

Outline of Annual Research Achievements

マウス・ヒトでのiPS細胞作製の報告以後、ブタにおいてもiPS細胞誘導の試みが数多くなされているが、外来遺伝子非依存的に未分化性・多能性を維持できるような高品質なブタiPS細胞の作製報告は未だなされていない。
本研究では、ヒト由来の細胞周期制御因子の導入によって、細胞老化が進み活発に分裂しなくなった体細胞からでも、高品質な（＝外来遺伝子に依存せず、個体や生殖細胞系列に寄与可能な）ブタ人工多能性幹細胞（iPS細胞）を作製することを目的としている。
初年度においては、細胞周期制御因子の導入による不死化細胞の作製、および、山中因子をはじめとする初期化因子をトランスポゾンを介して導入し、安定して継代の行えるマウス様ブタiPS細胞を作製することを目的とした。
当初は痕跡なしでの除去が可能なトランスポゾンを用いて細胞周期制御因子を導入することを予定していたが、共同研究先より、ヒト由来のcyclin DおよびCDK4、TERTをタンデムに連結した一つのコンストラクトでは従来通りの不死化細胞を作製することが難しいというデータを得たため、単一のトランスポゾンによる上記３因子の導入を一旦断念し、以前より実績のあるレンチウイルスベクターを介して、Oct3/4-EGFPトランスジェニックブタ由来の線維芽細胞の不死化をまず行った。
この不死化細胞に山中因子を含む様々な初期化関連因子をトランスポゾンを介して発現させ、iPS細胞の樹立を試みた。いくつかの遺伝子の組合せやベクターの改変の結果、以前よりも有効な遺伝子ベクターの構築に成功した。ただ培養条件等種々の検討を行ったが、Oct3/4-EGFPの蛍光を維持しつつ安定して継代を続けられるマウス様iPS細胞株を得るまでには至らなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初では1年目で、マウス様の高品質なiPS細胞を樹立することを目標としていたが、それを維持する培養条件の探索に予定よりも時間がかかっており、研究進捗はやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

引き続きマウス様状態を維持できる培養条件を早期に確立することを目指す。導入遺伝子の発現状態をrealtime PCR等で確認しつつ、細胞の性状解析に一刻も早く進めるようにする。