情動発達におけるＯｔｘ２ホメオタンパク質の機能解析

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J04599
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 飯島 友也 新潟大学, 大学院医歯学総合研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: Otx2 / ホメオタンパク質 / 情動発達 / 視床下部

Outline of Annual Research Achievements

Otx2ホメオタンパク質は初期発生において脳の形成に関わり、欠損すると脳全体が失われる重要な分子である。初期胚において、Otx2は脳領域全体に発現し、発生の過程に伴い著しく減少する。一方、生後脳では視覚機能の発達に関わり、網膜や外側膝状体などの領域で発現し、視覚野へ輸送されることで臨界期の開始と終了を制御していることがわかっている。
このことに加えて、申請者はこれまでにOtx2の網羅的発現解析を行い、脳全体での発現を観察していた。加えて、Otx2 KO遺伝子改変マウスでの恐怖条件付け行動解析実験では、恐怖記憶の形成に異常が見られ、Otx2の発現が情動発達に関わっていることを明らかにしていた。なお、この恐怖記憶の形成異常には雌雄差が見られた。この結果を受けて免疫組織化学的染色を用いてOtx2の局在をWT個体の雌雄で比較したところ、視床下部領域においてOtx2の局在に雌雄差があることを観察していた。
以上の結果とこれまでの知見により、Otx2は血液中から輸送され、視床下部領域に蓄積したのではないかという仮説が立てられ、今年度は視床下部と血液に着目して研究を行った。血液中Otx2量と視床下部のOtx2量に相関があるのではないかと考え、分子学的手法により血液中からOtx2を検出、定量をしようと試みた。しかし、結果として血中に含まれるOtx2を定量出来るほどの安定したデータは得られず、別の手段によるアプローチが必要であるという結論に至った。
また、構造的に観察が出来ていなかった下垂体についてもOtx2の発現解析を行ったところ、下垂体でも視床下部と同様に発現はないものの、Otx2の局在が観察され、輸送されている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は前年度の結果を受けて血液と視床下部についての解析を行った。
これまでの実験により、視床下部領域ではOtx2が発現していないものの、局在があることが明らかにされ、他の領域から輸送された可能性が示唆された。また、視床下部領域には物質の通り抜けが可能な有窓血管と呼ばれる構造が存在している。さらに当研究室では以前に血液中にOtx2が存在していることを示唆するデータも得られていた。これらのことから、血液中からOtx2が輸送されて視床下部に蓄積したのではないかという仮説が立てられ、それを明らかにするために血中Otx2量と視床下部のOtx2量の相関についての解析を試みた。
血中のOtx2の定量を試みたところ、未処理血清では多量に含まれるアルブミンを始めとしたタンパク質の存在によりOtx2の検出は難しかった。そこで免疫沈降によりアルブミンの除去とOtx2の濃縮を行い、ウェスタンブロッティングで検出しようと試みたが、様々な条件検討を行ったものの安定せず、定量を行えるほどのOtx2は検出できていない。この仮説は元々非常に挑戦的であり、すぐに結果が得られるような内容ではなかったが、Otx2の新たな可能性について考える上で、本年度の挑戦には意味があったと考えている。
また、構造的に観察ができていなかった下垂体についてもOtx2の発現解析を行ったところ、視床下部と同様に下垂体も発現はないものの、Otx2の局在が観察され、輸送を受けている可能性が示唆された。さらに、二重染色ではOtx2が特定の細胞に局在していることが観察された。

Strategy for Future Research Activity

本年度行った実験結果から、血液中に含まれるOtx2はウェスタンブロッティングなどの分子生物学的手法では検出が難しいと考えられた。今後は質量分析装置による血液の解析を外注して行うか、成体マウスを用いたin vivoでの方法によるアプローチを検討している。
また、下垂体においてはOtx2が特定の細胞に蓄積しているのが確認できたが、視床下部を始めとした他の領域ではOtx2がどの細胞に蓄積しているか明らかに出来ていない。免疫組織化学染色などを用いて各領域ごとのOtx2局在の特異性を明らかにしたいと考えている。
そして、本年度が研究課題の最終年度であるため、これまでのデータをまとめ、論文作成に向けて研究を進めるつもりである。